丹参素-丝裂霉素C挛药的制备及体外释放研究·

陈卓 谭李玉 尤静 张蕾

摘      要： 为了降低高毒性药物丝裂霉素C（MMC）在治疗翼状胬肉时的副作用，多靶点联合抑制翼状胬肉成纤维细胞，将其与具备抗成纤维细胞活性及血管保护作用的無毒药物丹参素（DSS）化学偶联为挛药MMC-DSS。体外释放研究表明，MMC-DSS可以积聚在眼表后逐渐释放MMC与丹参素以产生活性。从而获得了一种在翼状胬肉治疗中结膜血管副作用更低，且能够多靶点产生药效的全新挛药。

关  键  词：丹参素;丝裂霉素C;挛药;翼状胬肉

中图分类号：TQ 463       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）03-0459-03

Abstract： In order to reduce the side effects of Mitomycin C in the treatment of pterygium， twindrug MMC-DSS was prepared by chemical coupling of Danshensu and MMC. Its release in vitro was studied. The results showed that the twindrug MMC-DSS could amass in ocular surface and then release the MMC and the Danshensu to generate multi-target activity. A reduction of side-effects of MMC in the treatment of pterygium was achieved by this new twindrug through its multi-target therapy.

Key words： Danshensu; Mitomycin C ; Twindrug; Pterygium

翼状胬肉是一种当结膜持续性受到紫外线、风沙、雾霾等外界刺激后，在睑裂部球结膜引起成纤维细胞增殖导致的赘生性病变。翼状胬肉是高日照地区，如陕西、山西、内蒙、宁夏、青海、新疆、西藏等地区常见的眼科疾病，长期困扰着这些地区的群众尤其是长期户外作业者。翼状胬肉浸润角膜会导致散光，炎症，甚至失明[1]。翼状胬肉目前在眼科临床主要依靠手术切除[2]，切除后眼表残存的成纤维细胞具有很强的肿瘤样特征，如果术中、术后不加干预，残存的成纤维细胞会快速增殖，导致强复发[3]。因此，现行的临床治疗指南要求在手术切除翼状胬肉组织以后在结膜施用丝裂霉素C（Mitomycin C ， MMC）来抑制成纤维细胞的生长。但是，MMC的毒性较大，使用后会导致晶状体、玻璃体及视网膜等受损[4]。寻找低毒性的成纤维细胞抑制药物是目前翼状胬肉治疗中的重要任务。

丹参素（Danshensu，DSS）是中药丹参（Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhiza）中的活性成分，在临床上主要用于保护心、脑等脏器免收缺氧损伤[5]。近年来的研究发现，丹参素还具有抗成纤维细胞增生的作用[6]，其可以抑制肝星状细胞的增生，从而预防免疫性肝纤维化[7]，可以抑制人肾成纤维细胞的增生并诱导其凋亡[8];在眼科的研究也发现，丹参素可以有效抑制眼成纤维细胞的增殖，并诱导其凋亡，从而对眼部成纤维细胞增殖性疾病表现出良好的治疗作用[9]。

本研究将丝裂霉素C与丹参素通过化学合成的方法制备为挛药MMC-DSS（图1），此挛药有望具有以下三个优点：第一，使药物在靶部位同时释放丝裂霉素C及丹参素，两者抑制成纤维细胞增殖的机理不同[4，9]，可以产生双靶点协同作用，提高了药效;第二，丹参素的分子结构上除偶联反应使用的羧基外，还具有三个羟基，可以与水分子形成氢键，从而可以提高MMC的水溶性，使之难以透过角膜[10]，积累在亲水的结膜组织液中，随时间慢慢在结膜组织中发生水解反应，反应产物为一分子丝裂霉素C与一分子丹参素，这样既达到了靶向与翼状胬肉组织的作用，又达到了随水解反应缓释的效果;第三，丹参素对正常眼组织细胞的毒性远低于抗癌药物MMC，且具有血管保护作用[11]，两者联用可以在获得同等药效的前提下降低药物的副作用。本文对所获得的挛药分子MMC-DSS还进行了In Vitro drug release研究，发现其在人工泪液模拟的眼表环境下能够呈零级缓慢释放，这验证了我们对挛药功能的设计，有望获得一种新颖的翼状胬肉治疗药物（图1）。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  原料与试剂

丝裂霉素C纯度为98+% （MCE中国）;丹参素钠纯度为98+% （ark pharm）;N-甲基吗啉为分析纯（上海阿拉丁生化科技）;N-羟基琥珀酰亚胺为分析纯（安耐吉化学）;1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二酰亚胺盐酸盐（EDC·HCl）为分析纯（安耐吉化学）;其他常见有机溶剂、试剂均为分析纯，必要时干燥。

1.1.2  仪器

微量厚壁反应瓶为V131003型（北京欣维尔玻璃仪器有限公司）;高效液相色谱仪为1260型（美国安捷伦公司）;磁力搅拌低温槽为PSL-1810型（日本东京理化株式会社）。

1.2  MMC-DSS的制备研究

1.2.1  β-（3，4-二羟基苯基）乳酸N-羟基丁二酰亚胺酯（丹参素-NHS，化合物1）的制备向3 mL微量厚壁反应瓶中加入丹参素钠10.3 mg（46.8 μmol），EDC盐酸盐28.9 mg（151.3μmol）， N-羟基丁二酰亚胺5.8 mg（50.4 μmol），使用微量注射器加入100 μLN-甲基吗啉，加入0.7 mL DMSO后，在搅拌下溶解，N2保护下室温反应24h，将反应液倒入5 mL 2 N 盐酸与10 mL二氯甲烷的混合液中，充分震荡后分液，二氯甲烷层干燥后蒸干，得褐色油状物 5.16 mg，收率37.4%， 因极不稳定，不经检测直接用于下一步反应，投料前充N2保存于-20 ℃。

1.2.2 β-（3，4-二羟基苯基）乳酸酰丝裂霉素C（MMC-DSS）的制备

向3 mL微量厚壁反应瓶中加入β-（3，4-二羟基苯基）乳酸N-羟基丁二酰亚胺酯（丹参素-NHS，化合物1）3.2 mg（10.8 μmol），丝裂霉素C 3.6 mg（10.8 μmol）， 0.03 mol/L HBS緩冲液（pH为 7.4）2 mL，搅拌12 h，期间监控反应液pH，以微量注射器补充0.5 mol/L 氢氧化钠水溶液维持pH=7.4，减压蒸干反应液，所得油状物以硅胶柱色谱分离（氯仿：甲醇 100：1至10：1），得到黄色固体4.1 mg ，收率73.7%。经核磁共振波谱法验证为目标化合物MMC-DSS， 1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 8.89 （s， 1H）， 8.49 （s， 1H）， 6.65 （s， 1H）， 6.62 （d， J=8.0 Hz， 1H）， 6.48 （d， J=8.0 Hz， 1H）， 4.36 （m，2H）， 4.24 （d， J=10.2 Hz， 1H）， 3.76 （m， 2H）， 3.70 （s， 1H）， 3.11 （s， 3H）， 2.85（d， J=16.6 Hz， 1H）， 2.77（d， J=4.5 Hz， 1H）， 2.69（d， J=4.5 Hz， 1H）， 1.66 （s， 3H），1.16 （s， 1H）。

1.3  MMC-DSS的体外释放研究

本研究参考了陈卓[12，13]所发表的丝裂霉素C前药的体外释放研究方法。取氯化钠 6.78 g，氯化钾 1.38 g，碳酸氢钠 2.18 g加入1000 mL容量瓶中，加入约500 mL纯化水溶解，取氯化钙 0.084 g溶解于约200 mL纯化水后搅拌下加入上述容量瓶中，定容即得人工泪液。以人工泪液5 mL为溶出介质，向其中加入MMC-DSS 15 mg，控制释放液温度为（37±0.5）℃，控制搅拌子转速为约60 r/min。从加入MMC-DSS开始计时，每隔一定时间取释放液0.2 mL并补加人工泪液0.2 mL，释放液过滤后用HPLC测定其中丝裂霉素C的浓度。

丝裂霉素C测定的色谱条件为：安捷伦科技C18色谱柱（4.6 mm-150 mm-5μm），乙腈-磷酸缓冲液（15：85），流速1 mL/min，进样量20μL，柱温37 ℃，测定波长为365 nm。

2 结果与讨论

挛药MMC-DSS是将丹参素上的羧基与丝裂霉素C上的伯氨基成酰胺键。传统的制酰胺工艺有酰氯法和直接缩合法，即将丹参素上的羧基制成酰氯再与氨基反应或在DCC、DMAP体系下使丹参素的羧基直接与丝裂霉素C的氨基缩合。但是，丹参素的分子中既有羧基也有羟基，如果直接将丹参素与丝裂霉素C在DMAP/DCC、EDC等缩合剂存在的条件下成酰胺，或是将丹参素制备为酰氯再与丝裂霉素C成酰胺，其结果会导致丹参素自身分子间缩合成酯。为了避免这一情况，我们先将丹参素的羧基与N-羟基丁二酰亚胺缩合为不易与羟基反应的丹参素活性酯（丹参素-NHS，化合物1），再与MMC上的伯氨基以酰胺键连接，从而以较少的副反应和较简洁的步骤获得了目标化合物。

活性酯法相较酰氯法的优势还在于避免了丹参素的光学活性损失。天然丹参素具有手性，其手性碳为一个手性仲醇，在酰氯法所使用的酸性条件下非常容易发生消旋化[14]，导致产物的光学纯度下降，而活性酯法则避免了酸性环境的使用，从而避免了这一问题。

本研究使用了N-羟基丁二酰亚胺酯，即NHS活性酯，其优点在于上述的避免酸性环境使用从而保护了丹参素的光学活性。然后NHS活性在使用过程中还需要注意一些问题，否则将难以获得所期望的产物。第一，NHS活性酯的稳定性较差，一般在使用时采用原位制备的方式在获得后不经纯化直接用于下一步反应。这是因为常用的柱色谱法所采用的条件容易导致NHS活性酯水解，从而导致产物损失;第二，在获得NHS活性酯后，应当将其保存在低温冰箱中，并充氮气保存，从而避免所携带的杂质及空气中的氧气及水蒸气对活性酯的影响。

本研究将丝裂霉素C与丹参素制备的挛药MMC-DSS，经体外释放研究发现，其在人工泪液模拟的眼表环境下能够呈零级缓慢释放（表1），这验证了我们对挛药功能的预期，即药物在翼状胬肉患处同时释放丝裂霉素C及丹参素，两者通过不同的抑制成纤维细胞增殖机理，可以产生双靶点协同作用，提高药效，验证了课题设计，有望获得一种新颖的翼状胬肉治疗药物。

本研究在实验过程中使用了微量厚壁反应瓶代替传统上使用的圆底烧瓶。微量厚壁反应瓶具有以下几个优点：第一，相较于同体积的圆底烧瓶，由于其为细长结构，液面更深，更有利于温度计的探入测量，同时不容易因反应液在搅拌中飞溅粘在瓶壁上从而影响反应的进行;第二，配合特制的瓶盖后，因为其壁厚，可以耐压，可以适合于较高压的反应条件。这一点对反应工艺研究是十分有利的，使反应温度的摸索可以不完全受溶剂沸点的限制。在研究中，我们可以利用反应瓶耐压的特点，将温度升高至沸点后继续升温，这时由于内部密闭耐压，压力会逐渐升高，沸点也随之提高，可以使反应液的温度提高至溶剂沸点以上，从而探索在该温度下反应的情况。

3 结 论

设计并通过两步反应合成了双靶点挛药MMC-DSS。通过In Vitro drug release研究表明，其可以以前药形式靶向于翼状胬肉患处后逐渐释放丝裂霉素C与丹参素以产生双靶点活性，从而获得了一种新颖的、有望降低副作用的潜在翼状胬肉治疗药物。

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