渝东南地区土家特色酸鲊肉纯种发酵前期发酵条件优化

冉春霞 陈光静 邓惠玲

摘 要：采用响应面法优化渝东南地区土家特色酸鲊肉纯种发酵前期的发酵条件，在单因素试验的基础上，选取发酵时间、发酵温度、菌种接种量及白砂糖添加量为影响因子，以酸鲊肉前期发酵制品的乳酸脱氢酶活力、蛋白酶活力、脂肪酶活力为响应值，应用Box-Behnken试验设计建立数学模型。结果表明，酸鲊肉前期发酵的最优工艺条件为发酵时间30 h、发酵温度34 ℃、菌种接种量8%、白砂糖添加量4%，在此工艺条件下，得到酸鲊肉前期发酵制品的乳酸脱氢酶活力为102.92 U/mL，蛋白酶活力为41.58 U/mL，脂肪酶活力为11.86 U/mL，各评价指标达到相对较高水平。

关键词：酸鲊肉;纯种发酵;前期发酵;发酵条件优化

Abstract： Response surface methodology （RSM） was applied to optimize the pure culture per-fermentation conditions for Suanzharou. Using one-factor-at-a-time method， fermentation time， temperature， inoculum amount and sucrose addition were chosen as independent variable and the activities of lactate dehydrogenase， protease and lipase as response values. A mathematical model was established using the Box-Behnken experimental design. The optimal fermentation conditions were determined as follows： fermentation time 30 h， fermentation temperature 34 ℃， inoculum amount 8%， and sucrose addition 4%. Under these optimal conditions， the activities of lactate dehydrogenase， protease and lipase were 102.92， 41.58 and 11.86 U/mL， respectively， which were all desirable for Suanzharou processing

Keywords： Suanzharou; pure culture fermentation; pre-fermentation; optimization of fermentation conditions

“鲊”是用米粉、面粉等加盐和其他佐料拌制的切碎的菜，可贮藏，如酸鲊辣椒、酸鲊肉、酸鲊鱼等。酸鲊肉属于“鲊”的一种，是我国少数民族地区的传统特色发酵食品，其制作具有悠久的历史，2 000多年前的史书《齐民要术》中就有关于它的记载。在我国重庆、贵州、四川、湖南、广西的土家族、苗族、侗族、傣族及毛南族等少数民族地区被广泛食用，然而，不同地域、不同民族的人在酸鲊肉制作过程中所采用的原辅料和发酵工艺有所差別，因而形成不同的地域风味，同时也赋予酸鲊肉浓郁的民族特色。渝东南地区传统土家特色酸鲊肉是一种以新鲜猪五花肉为原料，将原料肉洗净后切片，然后将其与米粉、辣椒、食盐等辅料按一定比例混匀，装入坛子里，在自然条件下利用微生物的厌氧发酵作用而形成的一种乳酸菌型发酵肉制品[1]，具有肉质细腻、风味独特、肥而不腻等特点以及降血清胆固醇、调节胃肠道、抗氧化等生理保健功能[2-4]。经传统工艺制作的酸鲊肉可存放较长时间，这可能是由高盐含量、乳酸菌发酵产酸和细菌素、香辛料和茶叶等辅料含生物碱、茶多酚及黄酮类物质、严格的厌氧发酵环境等多重栅栏因子的综合作用所致[5-9]。但酸鲊肉的传统制作方式为自然发酵，生产差异性和随机性较大，发酵菌种和发酵条件难以控制，导致每批产品的品质不稳定;难以避免杂菌生长产生生物胺、亚硝酸盐等有毒、有害物质，危害食品安全，不适合工业化、规模化生产，严重影响酸鲊肉的产业化发展[10-13]。

纯种发酵是19世纪中后期，发酵生物学说建立后产生的[14]。现代发酵工业大多采用纯种发酵，它具有使有益菌快速生长、过程控制简单、目标产物生成速率快及减少有害物质积累等优点，可以解决传统发酵产品发酵过程中存在的上述问题，符合大批量生产的快速、易控要求，更适合工业化生产。在酸鲊肉发酵过程中，前期发酵主要是培养乳酸菌的过程，乳酸菌生长过程中分泌和积累一定量的乳酸脱氢酶、蛋白酶、脂肪酶等酶系，乳酸脱氢酶是糖酵解过程中重要的氧化还原酶，可以催化丙酮酸还原产生乳酸，从而赋予酸鲊肉特殊的酸味，同时pH值降低可以抑制杂菌生长、促进发色、降低亚硝酸盐残留和亚硝胺含量等[15-18];蛋白酶、脂肪酶等酶系在后期发酵中的协同作用可以提高酸鲊肉的营养价值，促进其独特风味的形成。但乳酸菌生长过程中产生酶系的活力受到发酵时间、发酵温度、乳酸菌接种量、糖添加量等因素的影响，因此，本研究采用响应面法优化酸鲊肉纯种发酵前期的发酵条件，这对实现酸鲊肉的工业化生产有积极意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪五花肉、米粉、白砂糖 重庆万州永辉超市。

植物乳杆菌（编号CICC21801） 中国工业微生物菌种保藏中心;蛋白胨、牛肉膏、酵母膏（均为生化试剂）、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸二铵、乙酸钠、蔗糖、吐温-80、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、碳酸钙、丙酮酸钠、钨酸钠、钼酸钠、体积分数85%磷酸、浓盐酸、硫酸锂、浓溴水、无水碳酸钠、三氯乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、干酪素、酪氨酸、聚乙烯醇（polyving akohol（PVA）、聚合度（1 750±50））、橄榄油、氢氧化钠、酚酞、体积分数95%乙醇（均为分析纯） 成都市科龙化工试剂厂;还原型辅酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）（优级纯）   法国生物梅里埃公司;MRS琼脂培养基 北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

BHC-1300ⅡA/B2生物洁净安全柜 浙江苏净净化设备有限公司;DHP-9602电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;YX-280A手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器 上海三申医疗器械有限公司;PTX-FA300电子分析天平 美国康州HZ电子科技有限公司;Hitech-Kflow超纯水仪 上海和泰仪器有限公司;DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂;T6紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;GTR16-2高速冷冻离心机 北京时代北利离心机有限公司;KQ-100E超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;XMTD-204数显式恒温水浴锅 上海跃进医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基配制

MRS液体培养基配制[19]：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸二铵2 g、乙酸钠5 g、蔗糖20 g、吐温-80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、碳酸钙1 g、蒸馏水1 000 mL、pH 6.2～6.4，121 ℃灭菌15～20 min。

1.3.2 菌悬液制备

冻干菌→全部溶解于0.5 mL MRS液体培养基→转入MRS液体培养基中活化（（36±1） ℃培养24～48 h）2～3 代→接入500 mL MRS液体培养基中扩大培养（（36±1） ℃培养24～48 h）→再经过8 000 r/min、4 ℃、10 min离心后用无菌生理盐水配制得到1×106～1×108 CFU/mL的菌种悬浮液→备用

1.3.3 前期发酵制品的制备

将猪肉切成片状，加入一定量的米粉和白砂糖，混匀后在紫外灯下进行灭菌处理（30 min）;然后将制备的菌悬液以喷洒的方式均匀接种到发酵原料上，接种量为8%（均为质量分数，下同），然后置于30 ℃条件下培养36 h，即得酸鲊肉的前期发酵制品。

1.3.4 粗酶液的制备

1.3.4.1 乳酸脱氢酶粗酶液的制备

准确称取充分研磨的前期发酵制品5 g，加入4 ℃预冷的pH 6.5磷酸缓冲液（m/V=1∶4），研磨破碎10 min，再用磷酸缓冲液将研磨后样品转入容量瓶并定容至100 mL，用纱布过滤，滤液在4 ℃条件下10 000 r/min离心15 min，收集上清液，即为乳酸脱氢酶粗酶液[20]。

1.3.4.2 蛋白酶粗酶液的制备

准确称取充分研磨的前期发酵制品5 g，加入50 mL蒸馏水，在（40.0±0.5） ℃水浴中间断搅拌，浸提1 h，转入容量瓶定容至100 mL，用纱布过滤，滤液3 500 r/min离心5 min，收集上清液，即为蛋白酶粗酶液[21-22]。

1.3.4.3 脂肪酶粗酶液的制备

准确称取充分研磨的前期发酵制品5 g，加入50 mL pH 7.5的磷酸缓冲溶液，在（40.0±0.5） ℃水浴中间断搅拌，浸提1 h，转入容量瓶定容至100 mL，用紗布过滤，滤液3 500 r/min离心5 min，收集上清液，即为脂肪酶粗酶液[22-23]。

1.3.5 前期发酵条件单因素试验

1.3.5.1 发酵时间对各酶活力的影响

将猪肉切成片状，按照质量比2∶1加入米粉，再加入4%的白砂糖，混匀后在紫外灯下灭菌处理30 min;将制备的菌悬液以喷洒的方式均匀接种到发酵原料上，接种量为8%，然后置于34 ℃条件下分别培养6、12、18、24、30、36、42 h，测定样品中乳酸脱氢酶、蛋白酶和脂肪酶的活力。

1.3.5.2 发酵温度对各酶活力的影响

将猪肉切成片状，按照质量比2∶1加入米粉，再加入4%的白砂糖，混匀后在紫外灯下灭菌处理30 min;将制备的菌悬液以喷洒的方式均匀接种到发酵原料上，接种量为8%，然后分别置于20、25、30、35、40、45 ℃条件下培养30 h，测定样品中乳酸脱氢酶、蛋白酶和脂肪酶的活力。

1.3.5.3 接种量对各酶活力的影响

将猪肉切成片状，按照质量比2∶1加入米粉，再加入4%的白砂糖，混匀后在紫外灯下灭菌处理30 min;将制备的菌悬液以喷洒的方式均匀接种到发酵原料上，接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%，然后分别置于34 ℃条件下培养30 h，测定样品中乳酸脱氢酶、蛋白酶和脂肪酶的活力。

1.3.5.4 白砂糖添加量对各酶活力的影响

将猪肉切成片状，按照质量比2∶1加入米粉，再分别加入0%、2%、4%、6%、8%的白砂糖，混匀后在紫外灯下灭菌处理30 min;将制备的菌悬液以喷洒的方式均匀接种到发酵原料上，接种量为8%，然后置于34 ℃条件下培养30 h，测定样品中乳酸脱氢酶、蛋白酶和脂肪酶的活力。

1.3.6 前期发酵条件响应面优化试验

采用Design Expert 7.0.0软件进行Box-Behnken响应面优化试验设计。根据单因素试验结果，选取发酵时间、发酵温度、接种量和白砂糖添加量作为试验因素，以乳酸脱氢酶、蛋白酶和脂肪酶的活力为响应值，试验因素及水平见表1。

1.3.7 指标测定

1.3.7.1 乳酸脱氢酶活力

在反应体系中加入磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）2.8 mL、NADH（6 mmol/L）0.1 mL、丙酮酸钠（30 mmol/L）0.1 mL、粗酶液20 L，25 ℃水浴5 min，测定反应体系在340 nm波长处的吸光度（磷酸盐缓冲液作为空白）。乳酸脱氢酶活力测定参照Zhao Rui等[20]的方法，将每1 min氧化分解1 mol NADH所需的酶液定义为1 个酶活力单位。

1.3.7.2 蛋白酶活力

参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》[21]，采用福林法进行测定。

1.3.7.3 脂肪酶活力

参照GB/T 23535—2009《脂肪酶制剂》[23]，采用PVA-橄榄油乳化液水解滴定法进行测定。

1.4 数据处理

采用Sigma Plot软件对数据进行分析和处理，每一指标均平行测定3 次;采用Design-Expert 7.0.0软件中的Response Surface（Box-Behnken试验设计）建立数学模型;采用方差分析对数据进行显著性分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 酸鲊肉前期发酵条件单因素试验结果

2.1.1 发酵时间对酸鲊肉前期发酵制品中各酶活力的影响

由图1可知，采用植物乳杆菌发酵原料肉时，酸鲊肉前期发酵制品中蛋白酶和脂肪酶活力在发酵30 h时达到最大，分别为40.80、11.85 U/mL，乳酸脱氢酶活力在发酵24 h时达到最大，为108.20 U/mL。综合考虑各酶系的酶活力情况，选择发酵时间为24～36 h较为适宜。

小写字母不同，表示同种酶不同组别酶活力差异显著（P<0.05）。图2～4同。

2.1.2 发酵温度对酸鲊肉前期发酵制品中各酶活力的影响

发酵温度是影响纯种发酵酸鲊肉制品品质的重要因素之一，温度过高或过低均会影响植物乳杆菌的生长，适宜的培养温度是植物乳杆菌正常生长的重要保证[24-25]。由图2可知，酸鲊肉前期发酵制品中乳酸脱氢酶活力在发酵温度30 ℃时最高，为109.20 U/mL，蛋白酶和脂肪酶活力在发酵温度35 ℃时最高，分别为41.10、11.59 U/mL。因此，选择发酵温度为30～40 ℃较为适宜。

2.1.3 接种量对酸鲊肉前期发酵制品中各酶活力的影响

由图3可知，当接种量从2%增加到8%时，酸鲊肉前期发酵制品中各酶活力逐渐升高，随着接种量继续增加，各酶活力开始下降，这可能是由于接种量过大时，单位体积内植物乳杆菌数也相应增加，其生长需要消耗的营养物质越多，菌体之间形成竞争关系，导致其较早衰退，影响产酶量和产酶活力[26-27]。因此，选择接种量为8%左右较为适宜。

2.1.4 白砂糖添加量对酸鲊肉前期发酵制品中各酶活力的影响

添加可发酵性糖有利于植物乳杆菌发酵产酸[28-29]。由图4可知，白砂糖添加量为0%～4%时，随着白砂糖添加量的增加，酸鲊肉前期发酵制品中各酶活力逐渐增加，当白砂糖添加量超过4%后，各酶活力开始下降。这可能是由于白砂糖添加量增加导致发酵体系渗透压增大，影响植物乳杆菌的生长繁殖，进而影响其产酶量和产酶活力[30];同时，白砂糖添加量过高会导致产品甜度较高而影响适口性。综合考虑，选择白砂糖添加量为2%～6%较为适宜。

2.2 酸鲊肉前期发酵条件响应面优化试验结果

响应面试验共设置29 个试验点，其中24 个析因点，5 个中心点，试验结果见表2。

2.2.1 发酵条件对酸鲊肉前期发酵制品中乳酸脱氢酶活力的影响

以发酵时间（X1）、发酵温度（X2）、接种量（X3）和白砂糖添加量（X4）为自变量，以乳酸脱氢酶活力（Y1）为因变量，建立回归模型。所得回归方程为Y1=101.91-2.85X1-3.59X2+0.40X3+2.72X4-0.25×10-2X1X3+0.87X1X4-7.20×10-2X2X3-0.50X3X4+0.32X12+0.89X22-4.17X32-4.86X42（模型1）。

由表3可知，模型极显著（P<0.000 1），因变量与所考察自变量之间的线性关系显著（R2=0.988 9），R2Adj=0.977 8，说明该模型能解释98.89%响应值的变化，拟合程度较好，失拟项不显著（P>0.05）。CV表示试验的精确度，其值越小，试验结果的可靠性越高，本研究中，CV=0.72%，在可接受范围内，说明试验结果可靠，所得二次回归方程能很好地预测响应值。由回归方程系数显著性检验可知，模型1的一次项X1、X2和X4影响极显著（P<0.01），X3影响显著（P<0.05），二次项X22、X32、X42影响极显著

（P<0.01），交互项X1X4影响显著（P<0.05）。

2.2.2 发酵条件对酸鲊肉前期发酵制品中蛋白酶活力的影响

以发酵时间（X1）、发酵温度（X2）、接种量（X3）和白砂糖添加量（X4）为自变量，以蛋白酶活力（Y2）为因变量，建立回归模型。所得回归方程为Y2=41.73+0.29X1-0.61X2+0.24X3+0.21X4-0.25×10-2X1X3-0.52X2X3+0.25×10-2X2X4+0.25×10-2X3X4-1.45X12-1.90X22-1.84X32-1.87X42（模型2）。

由表4可知，模型极显著（P<0.000 1），因变量与所考察自变量之间的线性关系显著（R2=0.967 8），R2Adj=0.935 6，说明该模型能解释96.78%响应值的变化，拟合程度较好，失拟项不显著（P>0.05）。CV=0.98%，在可接受范围内，说明试验结果可靠，所得二次回归方程能很好地预测响应值。由回归方程系数显著性检验可知，模型2的一次项X2影响极显著

（P<0.01），X1、X3影响显著（P<0.05），二次項X12、X22、X32和X42均影响极显著（P<0.01），交互项X2X3影响显著（P<0.05）。

2.2.3 发酵条件对酸鲊肉前期发酵制品中脂肪酶活力的影响

以发酵时间（X1）、发酵温度（X2）、接种量（X3）和白砂糖添加量（X4）为自变量，以脂肪酶活力（Y3）为因变量，建立回归模型。所得回归方程为Y3=11.79+0.21X1+0.22X2+0.074X3+0.23X4+7.20×10-2X1X2+0.05X1X4+0.25×10-2X2X3+0.14X3X4-0.52X12-0.48X22-0.76X32-0.69X42（模型3）。

由表5可知，模型极显著（P<0.000 1），因变量与所考察自变量之间的线性关系显著（R2=0.962 4），R2Adj=0.924 9，说明该模型能解释96.24%响应值的变化，拟合程度较好，失拟项不显著（P>0.05）。CV=1.44%，在可接受范围内，说明试验结果可靠，所得二次回归方程能很好地预测响应值。由回归方程系数显著性检验可知，模型3的一次项X1、X2、X4影响极显著（P<0.01），X3影响显著（P<0.05），二次项X12、X22、X32和X42均影响极显著（P<0.01），交互项X2X3影响显著（P<0.05）。

综合上述不同发酵条件对酸鲊肉前期发酵制品中乳酸脱氢酶、蛋白酶和脂肪酶酶活力的影响，经软件优化得出酸鲊肉前期发酵的最佳工艺条件为发酵时间29.89 h、发酵温度33.95 ℃、接种量8.12%、白砂糖添加量4.31%，此时酸鲊肉前期发酵制品中乳酸脱氢酶活力为103.07 U/mL，蛋白酶活力为41.77 U/mL，脂肪酶活力为11.73 U/mL。

2.3 验证实验

为检验试验结果与真实情况的一致性，对上述优化条件进行验证实验。同时考虑到实际可操作性，将最佳工艺条件修正为发酵时间30 h、发酵温度34 ℃、菌种接种量8%、白砂糖添加量4%，在此条件下进行3 次平行实验，得到酸鲊肉前期发酵制品中乳酸脱氢酶活力为102.92 U/mL，蛋白酶活力为41.58 U/mL，脂肪酶活力为11.86 U/mL，与模型预测值相比相对误差小于1%。因此，经响应面法优化所得的发酵最佳工艺参数准确可靠，具有实际应用价值。

3 结 论

通过响应面分析建立渝东南地区土家特色酸鲊肉纯种发酵前期发酵过程中发酵时间、发酵温度、菌种接种量和白砂糖添加量与乳酸脱氢酶活力、蛋白酶活力和脂肪酶活力之间的回归模型，结果表明，模型极显著，对试验拟合程度较好，有一定的实用价值。纯种发酵酸鲊肉的前期发酵最佳工艺条件为发酵时间30 h、发酵温度34 ℃、菌种接种量8%、白砂糖添加量4%，在此工艺条件下，酸鲊肉前期发酵制品中乳酸脱氢酶活力为102.92 U/mL，蛋白酶活力为41.58 U/mL，脂肪酶活力为11.86 U/mL，各评价指标达到相对较高水平。

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