不同月龄阶段关岭牛MYH3和MYH4基因mRNA表达水平的研究

2019-12-11杨沛方许厚强

养殖与饲料 2019年12期

覃海杨沛方陈伟许厚强陈祥周萍秦媛范瑞

高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室/贵州大学动物科学学院，贵阳550025；

关岭牛因其主要产区在关岭自治县而得名，与陕西秦川牛、山西晋南牛、山东鲁西牛和东北地区延边牛并称“中国五大名牛”，其主要的集中区域是盘江流域附近，同时关岭牛也是属于国家级别的重点保护畜禽之一。对于关岭牛而言，其拥有的5个特质主要是：拥有较高的出肉率且脂肪含量低、蛋白质和氨基酸含量高，同时繁殖率和屠宰率较高，以众多优点被评为贵州省地方性优良品种，塑造了“一生鲜草、一碗好肉”的良好品牌形象。

对于动物肌肉而言，其主要的成分蛋白是肌球蛋白。肌球蛋白在总体蛋白的比例为15%～25%，是一种非常保守的蛋白。在肌肉收缩、物质的运输工作等生理活动中均发现了肌球蛋白[1]。在分子结构水平上脊椎动物的肌球蛋白长度约为160 nm，同时还表现出了如同字母“Y”的形状，但并非对称结构[2]。肌球蛋白重链及轻链共同组成了肌球蛋白，也就是MYH 以及MLC，在这当中有2 条重链，分子质量在220 kμ 左右，而其中有4 条是轻链，分子质量在16～20 kμ 之间[3]。MYH 有850个氨基酸残基存在于N 端，并共同组成了球形头部，而MYH的尾部由C 端构成[4]。如果对球形头部进行划分，可大体上划分为3个主要功能区间，ATP的结合点在N 端的23 K，ATP 酶活性的激发是由第88个氨基酸所控制[5]，掌握肌肉收缩的是50K 区域，而肌动蛋白的结合位点是50K 区域。对于肌肉分化有主要影响的结构基因是MYH基因[6]。

MYH基因是控制肌肉发生分化的主要结构基因之一，基因的转录表达分析通常选用看家基因作为内参[7]。本研究以GAPDH作为内参基因，采用实时荧光定量PCR方法研究关岭牛MYH3和MYH4基因mRNA在不同发育阶段的表达水平，旨在为研究MYH3和MYH4基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本试验的试验动物是关岭牛，在贵州省安顺市西秀区幺铺镇关岭牛养殖场，挑选9 头关岭牛，选取其小肠、肝脏、肌肉、心脏、脂肪组织等，其中胎儿3 头、18月龄3 头、30月龄3 头，用碳酸二乙酯洗涤组织以去除表面血液，使用锡箔包好，放入液氮中，随后将其储存在-80℃冰箱中。

1.2 主要试剂

1.3 总RNA提取和cDNA合成

取50mg 组织样于液氮中研磨到只有米粒一般大小后，利用Tr-izol 法对关岭牛组织样品的总RNA进行提取，并选用微量分光光度检测其浓度与纯度。为了检测RNA是否完整，应该使用1.2%琼脂糖凝胶电泳。按照TransStartOne-Step gDNA Removal and cDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 反转录试剂盒操作说明进行反转录得到cDNA，反应体系见表1。25℃10 min 后，42℃30 min，85℃5 min，-20℃保存备用。

1.4 引物设计及荧光定量PCR

根据Genbank 登录的相关基因序列，结合Primer 5.0 软件分析，设计GAPDH、MYH3和MYH4基因特异性实时荧光定量PCR引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表2。

表1 反转录体系

实时荧光定量PCR反应是以cDNA 为模板，采用10 μL 反应体系（表3），整个分析过程是定量的，采用荧光定量PCR仪（CFX96，Bio-Rad，USA）。GAPDH作为内参基因，得到优化以后，其反应条件最佳为：在50℃条件下，孵育2 min，并在94℃的条件下预先变性5 min，并在该条件下进行30 s的变性，最后进行30 s的退火操作（退火所需温度如表2 所示），继而在72℃条件下进行30 s的延伸。需要进行检测的平行样品数为3个。当反应完成以后，可通过熔解曲线对PCR的反应特性进行研究判断，仅仅进行判断是不可行的，必须依据相应的定量分析结果，而其结果还需要依照标准曲线及Ct值的计算获取。

表2 实时荧光定量PCR扩增引物序列及参数

1.5 数据分析

在本次试验方案中，将GAPDH基因作为内参基因，并通过SPSS 18.0 软件对样品进行Ct平均值及标准偏差的计算工作。应用2-△△CT法处理数据，研究在不同年龄阶段的MYH3基因以及MYH4基因mRNA的表达情况。

2 结果与分析

2.1 RNA提取与RT-PCR结果分析

总RNA通过1.2%琼脂糖凝胶电泳，发现其有着清晰的不同条带（图1），适用于逆转录。用MYH3基因、MYH4基因和GAPDH基因引物先在普通PCR仪上进行PCR扩增，检测是否为目的条带。

2.2 荧光定量PCR产物特异性分析

图1 总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果

本试验对MYH3基因和MYH4基因在关岭牛不同月龄中的表达量进行了分析，结果发现，对于GAPDH、MYH3和MYH4基因，其扩增曲线呈现S型（分别见图2和图3），这说明GAPDH、MYH3和MYH4基因有着较好的平行性，且其拐点十分明显，在基线上没有明显的上升发展，梯度模版熔解曲线比较紧密（分别见图4和图5）。且只存在1个显著的峰，这说明实际的特定增产物造成荧光的强度。实时荧光定量PCR时，内参及目标基因不会发生非特异性扩增和引物二聚体，因此以后试验仍可用。

2.3 MYH3和MYH4基因在关岭牛不同发育时期mRNA表达水平的分析

图6 为MYH3和MYH42个基因mRNA在关岭牛不同年龄的表达，可以看出表达MYH3基因和MYH4基因mRNA最高的是30月龄的背最长肌，然后为18月龄的背最长肌，而胎儿中的背最长肌表达量则非常少。

图2 GAPDH基因的扩增曲线

图3 MYH3基因和MYH4基因的扩增曲线

图4 GAPDH基因的熔解曲线

图5 MYH3基因和MYH4基因的熔解曲线

图6 MYH3和MYH4基因在关岭牛不同发育时期中的表达

3 讨论

肌球蛋白的分子结构变化是由于2个MHC 球形头部的循环运动造成的，也使得其与ATP 得到了有效的融合，这使得肌动蛋白很难与头部进行有效的融合，而此时，ATP的水解反应会产生强力的运动反应[8]。在对mRNA进行定量检测的过程中，必须通过内参基因对目标基因进行表达量的确定[9]。通过此次试验，关岭牛的MYH3基因和MYH4基因表达最高的是30月龄的关岭牛背最长肌，其次为18月龄的背最长肌，在胎儿背最长肌组织中表达量最低。MYH3基因和MYH4基因由胎儿到18月龄表达量有大幅度提升。Ennion 等[10]经过研究认为组织特异性与发育阶段控制了MYH基因的表达；Olsvik 等[11]研究发现MYH基因在胚胎发育和组织样品间均表达不稳定。综上所述，MYH3基因和MYH4基因在出生后的动物肌肉组织中表达量相对较高，MYH3基因和MYH4基因随着出生时间的推移呈上升趋势，推测其表达水平与肌肉发育的程度有一定的关系，但具体的作用机制比较复杂，还需通过其他试验进行验证。