响应面法优化麻花艽中苦苷类成分提取工艺

姚 政,聂颖杰，王 怡,王 泽,林鹏程

(1.青海民族大学 药学院，青海 西宁 810007；2.青海民族大学 青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室,青海 西宁 810007；3.青海民族大学 青海省药物分析重点实验室，青海 西宁 810007)

麻花艽(GentianastramineaMaxim.)为龙胆科龙胆属植物，在藏药中名为“吉解嘎保”，其味辛、苦，性平，入胃、肝、胆经，具有祛风湿、清湿热、止痹痛、退虚热的功效，用于风湿痹痛、中风、半身不遂、筋脉拘挛、骨节酸痛、湿热黄疸、骨蒸潮热、小儿疳积发热等[1-2].其主要的化学成分有龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷等[3-4].现代药理学研究表明，麻花艽有抗氧化、抗炎、抗过敏等作用[5-7].

近年来，在工艺优化方面，对麻花艽苦苷类的研究多集中在龙胆苦苷[8-9]，未见有对龙胆苦苷和獐牙菜苷综合的考察.我们在前人研究基础上[10]，采用Box-Behnken中心组合试验，通过响应面法优化麻花艽地上部分中苦苷类成分(龙胆苦苷和獐牙菜苷)的提取工艺，确定了麻花艽地上部分中苦苷类成分的最佳提取工艺参数.

1 仪器与材料

1.1 仪器

FZ102微型粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，高效液相色谱仪(配置：手动进样器，在线脱气机，高压二元梯度泵，恒温柱温箱，DAD检测器，Agilent 1100色谱工作站).

1.2 材料

麻花艽地上部分于2017年8月采自青海省海南州同德县，经青海民族大学林鹏程教授鉴定为藏药麻花艽(GentianastramineaMaxim.).将麻花艽地上部分阴干，粉碎，备用.

龙胆苦苷、獐牙菜苷标准品(HPLC归一化法检测，纯度大于98%)；色谱甲醇(山东禹王实业有限公司禹城化工厂)；水为超纯水(优普，ULUPURE).

2 实验方法

2.1 对照品溶液的制备

取2.4 mg龙胆苦苷和2.9 mg獐牙菜苷标准品置于1 mL容量瓶中，用移液管吸取甲醇溶解并定容，得到标准品溶液浓度分别为2.4 mg/mL和2.9 mg/mL.

2.2 样品溶液的制备

精确称取麻花艽1.0 g，粉碎，加入10 mL的甲醇，超声提取30 min，以5 mL的甲醇分两次洗涤滤渣，过0.45 μm滤膜，滤液定容至25 mL.

2.3 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS (250 mm×4.6 mm，5 μm)柱.流动相：以水(含0.02% H3PO4)甲醇在0～10 min内用20%的甲醇水溶液等度洗脱，20%～50%甲醇水溶液10 min～30 min.检测波长为254 nm，流速为1 mL/min，柱温为35 ℃.考查指标为两者含量之和，混合对照品及麻花艽样品色谱图见图1.

1：龙胆苦苷(gentiopicroside)，2：獐芽菜苷(sweorside)

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

分别称取龙胆苦苷、獐牙菜苷对照品，用色谱甲醇配制成含龙胆苦苷0.045 0 mg/mL、獐牙菜苷0.0084 mg/mL的混合标准对照品溶液，精确吸取混合标准对照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μL分别进样，以各进样量为横坐标，各自的峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，回归方程见表1.

表1对照品的线性方程及线性范围

2.4.2 检测限

在2.3色谱条件下，对各组分的最低检测限进行测定，当信噪比是S/N=3 时，测得最低检测限为：龙胆苦苷0.50 ng，獐牙菜苷0.84 ng.

2.4.3 精密度实验

取2.4条件下的标准品溶液，在2.3色谱条件下进样，每次10 μL，重复6次.测定色谱峰的峰面积，测得龙胆苦苷、獐牙菜苷峰面积的RSD分别为2.03%、2.68%.

2.4.4 重复性实验

称取麻花艽样品0.5 g，共6份，在2.3色谱条件下进样，每次10 μL，测得龙胆苦苷、獐牙菜苷含量的RSD分别为1.58%、1.88%.

2.4.5 稳定性实验

精确称取麻花艽样品地上部分0.5 g，共6份，按2.2提取方法操作，分别在0、2、4、6、8 h时分别进样，测定各色谱峰面积.通过计算龙胆苦苷、獐牙菜苷RSD 分别为0.75%、0.82%.表明供试品溶液在8 h内稳定.

2.4.6 加标回收率实验

称取3份已测得含量的麻花艽地上部分样品0.500 g，添加各对照品溶液适量，按2.2提取方法操作，测得龙胆苦苷的平均回收率(n= 3)为99.5%，獐牙菜苷平均回收率为103.2%；RSD分别为2.5%、3.0%.

2.5 提取工艺选择

结合前期实验的基础及相关参考文献[10]，将温度设为68 ℃、料液比为1∶12、提取次数为3次，对提取工艺进行选择.

2.5.1 提取溶剂对苦苷提取率的影响

称取3份麻花艽地上部位样品，每份0.5 g，分别以95%乙醇、50%乙醇、水为溶剂，各提取3次，热回流法提取.料液比1∶20，每次0.5 h，合并提取液，浓缩后定容至50 mL.按2.3的HPLC条件进行实验，测定上述龙胆苦苷和獐牙菜苷总含量.3种提取溶剂中，对苦苷提取率:95%乙醇(89.7%)>50%乙醇(86.1%)>水(81.7%).3个条件提取率相差不大.以水为提取溶剂简便易行,成本低,因此提取溶剂选择水.

2.5.2 提取方法对苦苷提取率的影响

称取2份样品，每份0.5 g，料液比1∶20，用超声波提取、热回流提取，每次0.5 h，提取3次.合并提取液，浓缩后定容至50 mL.按2.3的HPLC条件进行实验,测定上述龙胆苦苷和獐牙菜苷总含量.两种提取方法中，超声法(82.8%)对苦苷总提取率最高，热回流提取法(79.5%)和超声波相差3.3%.相比于超声波，在企业中热回流设备普及率高，故选择热回流提取法.

3 结果与分析

3.1 响应面优化麻花艽苦苷类成分提取工艺结果

表2响应面试验因素及水平

3.2 响应面试验结果

3.2.1 提取工艺对苦苷类成分含量的影响

以龙胆苦苷和獐牙菜苷的总量作为响应值R，实验设计和结果见表3.

3.2.2 龙胆苦苷和獐牙菜苷总量响应值的方差分析

使用Design-Expert8.0.6软件对龙胆苦苷和獐牙菜苷总量响应值进行二次多项式回归拟合及方差分析，结果见表4.

表3响应面实验设计方案与结果

表4 龙胆苦苷和獐牙菜苷总量响应值的方差分析表

由表4可知，对龙胆苦苷和獐牙菜苷总量回归模型进行F检验，P值为0.001 4，说明模型极显著；决定系数(R2)为0.986 9，修正后决定系数为0.963 4，说明实验值与预测值之间具有相关性.对所建模型的拟合度进行失拟分析，其F值为0.086，P值为0.964 1，说明模型可准确预测相应变量.在所考察的独立因素、因素间交互项及因素的二次项中，因素A、A2、C2为显著影响因素，说明其对龙胆苦苷和獐牙菜苷总量提取效果的影响较大.通过方差分析得到的二次多项回归方程R=-34.642+0.6863A+0.355B+3.742C+5.400×10-3AB- 1.7750×10-3AC+0.0159BC-5.2040×10-3A2-0.1281B2-0.1491C2.响应面3D曲面图可以直观地反映两两因素的交互作用及各因素对响应值的影响.各响应值的响应面3D图谱见图2.

由图2可知，随着各因素水平值的升高，龙胆苦苷和獐牙菜苷总量均呈现先升高后下降的趋势，但该趋势在温度的变化中表现更为显著、料液比和提取次数影响较小.

图2 温度(A)、提取次数(B)、料液比(C)对龙胆苦苷和獐牙菜苷总量的响应面图

在上述结果的基础上，通过Design-Expert8.0.6软件对麻花艽中龙胆苦苷和獐牙菜苷总量的提取工艺进行优化，以龙胆苦苷和獐牙菜苷总量最高为指标，并在各因素的水平范围内选择最佳参数.最佳工艺为：提取温度为65.68 ℃、料液比为1∶12.35、提取次数为3.54次，在此条件下龙胆苦苷和獐牙菜苷总量为11.636 mg/g.

3.2.3 提取工艺的优化和验证

对响应面优化所得的龙胆苦苷和獐牙菜苷总量的提取工艺进行验证.为方便操作，选择提取温度为66 ℃、料液比为1∶12、提取次数为3次，进行验证试验，测定龙胆苦苷和獐牙菜苷的总量为11.58 mg/g.在此工艺条件下，重复3次实验测得龙胆苦苷和獐牙菜苷总量的实际含量的平均值为10.93 mg/g，与理论值比较接近，故采用Design-Expert8.0.6软件设计得到的龙胆苦苷和獐牙菜苷总量的提取方法可靠，效果最佳.

4 结论

本研究运用响应面分析法对麻花艽样品地上部位中苦苷类成分的提取工艺(温度、料液比、提取次数)进行考察，以龙胆苦苷和獐牙菜苷的总量为指标，得最佳提取工艺为提取温度66 ℃、料液比1∶12、提取次数3次.在此优化条件下，麻花艽样品地上部位中龙胆苦苷和獐牙菜苷的总量为10.93 mg/g，并通过验证实验证明了麻花艽样品地上部位中苦苷类成分提取工艺的可靠性和优越性，表明藏药麻花艽地上部位具有一定的药用价值.该提取工艺可为藏药麻花艽地上部位中苦苷类成分的提取提供一定的参考价值.同时，为藏药麻花艽地上部位的综合开发提供一定的理论依据.