水稻OsHOX6启动子的组织特异性表达

何 丹，玉山江·麦麦提，杨 渡,韩 盛,Inez Hortense Slamet-Loedin

(1.新疆维吾尔自治区林业技术推广总站，乌鲁木齐 830000；.农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室/新疆农业科学院植物保护研究所，乌鲁木齐 830091；3.国际水稻研究所作物育种和生物化学系转基因研究室， 菲律宾)

0 引 言

【研究意义】常见的非生物逆境胁迫环境因子包括干旱、高盐、低温等，制约了植物的生长发育，影响作物的产量。挖掘水稻抗逆基因并进行功能分析及其机理研究是抗逆育种的基石，水稻的根系生长发育情况与其抗旱性、抗盐碱性、抗菌害及地上部分的生理情况关系密切。水稻根系的形态、生理特性与抗逆性有直接关系[1]。虽然对双子叶模拟植物拟南芥的根系生长发育的研究较多，可典型的单子叶植物水稻根系形成与发育控制基因相关研究则比较有限，水稻根系生长发育的调控网络与分子机理以及根系生长发育相关基因 有待进一步进行克隆和功能研究。水稻根系形成由几个转录因子、激素以及表观遗传控制[2]。水稻侧根是在中柱鞘细胞和内皮层细胞部位发生的[3-4]。根的内皮层是根的最基本组织结构，由分生组织分化形成，由数层薄壁细胞构成，可以起到保护作用，也能控制对物质运输与根生长发育的信号中心[5]。【前人研究进展】多数研究认为，水稻的根系发育和较多外界因素息息相关，尤其与植物激素关系密切。早期相关研究已经表明，诸多外界因素影响着水稻的根系发育，以植物激素尤为明显。植物生长素在水稻侧根和不定根生长，向性反映和维管组织细胞分化等具有关键作用[6]。研究认为较低浓度的植物生长素能够促进根系生长，而生长素高于一定浓度会抑制水稻根系生长。双子叶模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)与单子叶植物水稻的根系存在明显差异，双子叶植物拟南芥为直根系，没有不定根，而单子植物水稻为不定根系，具有发达的须根系。水稻的根系结构非常复杂，有不同的根系类型，包括胚胎初生根、侧根和冠根[7]，水稻冠根可持续分化两种不同类型的二级根，即小侧根和大侧根。大侧根有不定性和向地性，但大侧根无向地性，通常具有确定性。水稻小侧根数量较多，没有分支，常有小侧根和大侧根[8]。葫芦卜中的HD-Zip转录因子CHB1/2/3控制体细胞中胚胎发送的基因表达，CHB2参与到胚胎的早期发育过程，在成熟的番茄植物中Vahox1在次生生长的韧皮部也能表达，说明其编码产物优先参加到形成层到韧皮部组织的分化过程[9，10]。转录因子Oshox1 and Oshox4可能是发育抑制因子。属于HD-ZipⅠ家族的Habh-4在初步转基因拟南芥里过量表达时，能够表现出较为明显的抗旱性[11]。试验表明，过量表达的Oshox1能够改变拟南芥叶片的形状和大小、抑制其的生长，且其抑制效应与它的DNA结合位点和HD基序的上游序列有关；过量表达的Oshox4水稻能够改变叶片、开花期、株高等，这与在GA3的反应中充分表现出负调控作用[12]。水稻的OsHOX6、Oshox22和Oshox24与AtHB7和AtHB12基因具有一定的同源性，在进行干旱胁迫时这些基因会进行对应干旱调控，但截至目前关于此类基因的抗旱功能方面未见报道[13，14]。【本研究切入点】对水稻HD-Zip转录因子亚家族I的部分基因功能进行了研究，可OsHOX6基因与启动子的功能未见报道。研究在OsHOX6基因启动子特异性表达。【拟解决的关键问题】研究OsHOX6基因启动子调控GUS基因表达的模式，证实OsHOX6基因主要在根尖的顶端分生区与内皮层表达。

1 材料与方法

1.1 材 料

采用RT-PCR法，以HPT (潮霉素)引物与OsHOX6引物从水稻中克隆得到OsHOX6基因启动子，以常规品种‘IR64’作为水稻材料，含GUS双元载体pCAMIA1302 的LBA4404根癌农杆菌菌系用于转基因。限制性内切酶，T4DNA连接酶等均由Invitrogen公司购买，载体构件中使用的是DH50大肠杆菌菌株。表1，图1

表1 引物序列
Table 1 Primers sequence

上游引物Upstreamofprimer序列(5'-3')Sequence(5'-3')下游引Downstreamofprimer序列(3'-5')Sequence((3'-5')HPT-FGCCTGACCTATTGCATCTCCHPT-RAATTGCCGTCAACCAAGCTCOsHOX6-FGTGGATGATGATGGACGTTGOsHOX6-RGCGAGCTTCTCCTTCTTGAG

图1 植物表达载体pCAMBIA1302-OsHOX6+GUS-Nos3的T-DNA结构
Fig.1 Structure of T-DNA region in plant binary vector of pCAMBIA1302-OsHOX6+GUS-Nos3

1.2 方 法

1.2.1 农杆菌介导的转化

将未成熟种子的外壳去掉，消毒后在超净工作台内，从种子里分离出未成熟的胚并N6培养基上，以农杆菌进行侵染后，在25℃，黑暗条件下培养7 d后，置于选择培养基上持续培养5 d，诱导出抗性愈伤组织放到选择性培养基继续培养10 d，筛选出健康的绿色愈伤组织，置于分化培养基中培养15 d长出绿色分化苗，将幼苗转移到有生根培养基的试管中培养至生根，移栽至花盆锻苗15 d后，移到温室培养[15]。

1.2.2 转基因水稻PCR鉴定

采用快速提取DNA试剂盒方法提取总DNA，根据潮霉素基因组序列与OsHOX6基因设计引物HPT-F,和HPT-R，OsHOX6-F和OsHOX6-R。表1

1.2.3 GUS组织化学染色

将转基因水稻苗和野生型水稻苗的根、茎、叶和花器官剪下置于1.5 μL离心管中，加入Gus染色液，37℃染色4 h；取出材料，转入75%酒精中脱色2～3次；肉眼或者显微镜下观察染色结果。

2 结果与分析

2.1 OsHOX6转基因水稻的PCR鉴定

采用两对特异性引物对T0代的转基因水稻植物进行PCR鉴定。研究表明，Hpt1和Hpt1扩增出529 bp的目标片段; OsHOX6特异性引物可扩增出280 和350 bp两条片段；使用Hpt primer进行PCR检测时候，转基因水稻的幼苗扩增出一条与预期大小一致的片段，使用OsHOX6引物进行PCR检测，转基因水稻幼苗中扩增出两条与预期大小一致的片段，而对照野生型水稻中只有一条带。图2，图3

图2 用HPT primer转基因植株PCR
Fig.2 Using HPT primer confirm positive plant

图3 用OsHOX6 primer 转基因植株 PCR阳性检测阳性检测
Fig.3 using OsHOX6 primer confirm positive plant

2.2 Gus 基因在不同组织的特异性表达

对水稻的花粉、花药、种皮和叶片均进行染色后发现，Gus目标基因在水稻的花粉和部分受伤处均能表达，但在水稻种皮和叶片的椰肉部分未见表达，目标基因能在花药与花粉等生殖细胞中表达，同时在损伤部分与叶脉中也表达。图4

2.3 Gus 基因在根内皮层的特异性表达

经过染色实验发现水稻的侧根能被染色，且染色均匀，OsHOX6启动子能够在水稻的侧根进行特异性表达。通过对侧根的解剖结构进行分析可以看出，侧根维管束内皮层均被染均匀的蓝色，OsHOX6启动子在侧根的维管束内皮层内能够进行特异性表达。图5

3 讨 论

植物HD-Zip转录因子又可以分为四大亚类(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，HD-Zip 家族转录因子亚家族I、II，基因表达干旱，高盐，ABA和冷害等环境的诱导，这两类基因参与基因信号途径，通过与激素途径基因与下游基因互作来调控植物细胞扩增，分裂与分化，从而提高植物的耐逆性。HD-Zip 转录因子可以调控植物特有发育进程，其中包括细胞分化和形态建成等。在早期的研究中己经了解到水稻的根系发育与众多外界因素息息相关，尤其植物激素。研究表明，生长素在促进不定根、侧根生长、维管组织分化、向性反应等过程中起着非常关键的作用。水稻HD-Zip转录因子亚家族I的OsHOX6基因启动子在水稻内皮层中特异性表达。水稻具有较为复杂和发达的根系结构和不同的根系类型，包含胚胎初生根、冠根和侧根，冠根可以继续分化产生两种类型的二级根，大侧根和小侧根。研究结果表明，OsHOX6基因启动子主要表达在侧根的内皮层，叶片叶脉、花粉与损伤的组织，弄清HD-Zip I转录因子OsHOX6基因和启动子在根系形成与发育的基因调控网络方面需要进一步深入研究。OsHOX6基因启动子在花粉和对水稻机械损伤部位能够表达，此启动子在花粉活性和昆虫对植物的危害机制等方面的研究上具有一定意义。同时在花粉与组织损伤部分表达，HD-Zip I转录因子OsHOX6通过调控哪些基因形成根部内皮层干细胞的、分裂和分化以及根内皮层形成有关基因关系需进一步深入研究。

A：Gus基因水稻花药里的表达 B：Gus基因在水稻花粉里表达 C：Gus基因在损伤部分表达D：Gus基因在叶片叶脉中表达

A：Gusgene expression in rice anther B:Gusgene expression in rice pollen C:Gusgene expression in wound D:Gusgene wound expression

图4Gus基因特异性的在水稻不同组织中表达
Fig. 4Gusgene specific expression in different tissue

A:Gus基因表达在主根 B：Gus基因在侧根 C和 D ：Gus基因在根的内皮层

A：Gusgene expression in main root B:Gusgene expression in lateral root C and D :Gusgene expression in the root endodermis

图5Gus基因表达在冠根、侧根及其内皮层
Fig.5Gusgene expression in the main root 、lateral root and endodermis

4 结 论

IR64中的OsHOX6 启动子驱动的GUS基因，主要表达在水稻叶片叶脉、损伤部分、侧根及根的内皮层，在侧根与根内皮层中表达量非常强，在叶片叶肉与果实中未见表达。OsHOX6启动子在水稻内皮层中特异性表达，一部分表皮细胞的外壁向外延伸形成吸管状的根毛，根毛的对根的吸水作用极为重要，OsHOX6启动子在侧根内皮层特异性表达并随着侧根的细化，表达量增强，OsHOX6启动子连接到根的生长有关的基因，把基因特异的表达在根内皮层里，提高作物的吸水能力。 OsHOX6启动子在机械损伤时也能表达。