达坂城蚕豆根腐病病原菌鉴定及生防菌拮抗效果分析

楚 敏，顾美英，唐琦勇，朱 静，郝秀英，张志东

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】近年来，达坂城地区蚕豆大面积出现根茎病害，导致蚕豆大面积死苗、植株干枯，减产严重，甚至绝产。2009年后达坂城地区蚕豆种植面积削减90%以上，2016年后种植面积不足千亩，严重影响了达坂城蚕豆品牌的发展[1]。【前人研究进展】蚕豆是典型的忌连作作物，长年连作会导致其根茎病害发病严重[2]。根据发病部位的不同，蚕豆根茎病害可分为根腐病和茎腐病，其病原菌的区系组成以镰刀菌为主，极少数为立枯丝核菌引起，其发病一般在蚕豆花期发生，田间积水或苗期浇水过早，病害发生重。相关研究表明，其发病率与土壤温度、田间湿度、品种病害敏感性呈正相关[2]。【本研究切入点】此前未见达坂城地区蚕豆有根茎病害发病的报道。 2009年以来，达坂城区域蚕豆根茎病害发病日益严重，主要采用加大轮作，降低种植密度外，多采用甲霜灵、福美双按5∶1比例复配后灌根的方法[3]降低相关病害的发病率，达坂城蚕豆根茎发病规律、致病菌种类及生物防治等，目前尚无研究报道。研究鉴定达坂城蚕豆根腐病病原菌。【拟解决的关键问题】实地调查达坂城本地特色蚕豆品种根茎病害发病情况并采样，进行病原菌的分离鉴定，研究达坂城蚕豆病原菌的分类学地位；通过平板拮抗实验，分析市面销售微生物菌剂对病原菌株的拮抗效果，为达坂城蚕豆根茎病害的科学生物防治提供科学依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病株采集

采样地位于达坂城地区(43°21.284’ N, 88°21.277’ E)，海拔高度在1 100 m左右，属于中温带大陆性气候地区，干旱少雨，年平均降水量43.4 mm，寒暑变化剧烈，气候差异较大，多大风天气，年平均气温6.3～7.5℃，1月平均气温为-10.6℃，7月平均气温为18℃[4]。

采样地位于达坂城镇东南10 km处，农田面积1.67 hm2(25亩)，土质为沙砾土，所种植蚕豆为达坂城蚕豆(农民自留种)，耕作模式为机械耕种，覆膜播种，轮作种植(前一年种植为玉米)，灌溉采用大水漫灌。

分别于2018年6月22日和7月3日前往达坂城农田，采集不同发病程度的病株10株，整株采用灭菌的牛皮纸包裹后放置车载冰箱，在4 h以内分离病株的病原菌。

1.1.2 真菌拮抗菌

芽孢杆菌B6，前期分离的苹果腐烂病病原菌拮抗菌，保存于新疆农业科学院微生物应用研究所菌种保藏库。枯草芽孢杆菌B1，由新疆神威生物股份有限公司提供。

1.1.3 试剂和设备

PDA培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，青岛海博生物技术有限公司；真菌DNA基因组试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术技术有限责任公司。

CP153电子精密天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司； Nikon 80I荧光显微镜型尼康显微镜，日本Nikon尼康公司; SW-CJ-2F 型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司; BPH-9042型电热恒温培养箱； SPX-250B-Z生化培箱，上海博迅实业有限公司；Eppendorf 5417R型离心机，艾本德中国有限公司。

1. 2 方 法

1.2.1 根茎病害发病情况

调查田块按双对角线蛇性布点，共设9个点，每个调查点观察植物50棵，对发现的植物病株进行病情确定，并统计每个点的发病等级和发病率[5]。调查病害分为5类,0级：根、茎基部无病斑、无变色，生长健康；1级：茎基部或根部稍有病斑，地上部无不良症状；2级：茎基部或主侧有病斑，但不连片，地上部无不良症状；3级：茎基部或根部小于1/3～1/2出现病斑，地上部萎蔫，变黄；4级：茎基部或根部病斑环绕，枯萎，落叶，但植株不死亡；5级：植株死亡[6]。

1.2.2 病原菌的分离

挑选具有典型症状的病株，去叶留主枝干和根，自来水下冲洗，去除表面泥土和浮灰， 无菌滤纸擦拭。在无菌工作台中，使用70%酒精表面消毒30 s，其后1.2% NaClO消毒3 min，用无菌蒸馏水清洗3次进行表面消毒，放在无菌滤纸上晾干。 切取5 mm×5 mm左右具有典型病征的组织块，移至准备好的PDA(含氯霉素)和玫瑰红钠琼脂培养基上，置于28℃恒温培养，并观察菌落长出后挑取边缘菌丝，进行菌种纯化和保藏[7]。

1.2.3 病原菌致病性测定

采用烫伤接种方法，选取健康达坂城蚕豆枝干，截成10 cm长的小段，自来水冲洗后用0.1% HgCl消毒，然后用无菌水冲洗，滤纸擦拭，晾干，顶端石螬封口。将烧红针头按一定间隔烫伤枝条韧皮部，无菌接种针挑取病原菌菌丝接种烫伤部位，浸湿的脱脂棉轻轻附上后，用塑料保鲜膜将接种处包扎。接种后将枝条放入湿沙盘中，28℃保湿培养，于接种后6、10和15 d观察记录枝条发病情况。

1.2.4 菌株的分子生物学鉴定

病原真菌ITS 序列采用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’， ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’进行ITS序列PCR扩增。PCR产物经切胶纯化回收后，送往北京鼎国生物技术有限公司进行测序，所测得序列人工校正后，真菌序列在http://www.westerdijkinstitute.nl/Collections/DefaultInfo.aspx数据库上进行比对，细菌序列在EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)数据库上进行比对，并分别调取同源性最高模式菌株及相关菌株序列。

1.2.5 生防菌拮抗效果

拮抗菌的筛选采用平板对峙法进行。以分离到的病原菌为指示菌，接种于PDA平板中心，拮抗菌采用四点对峙法接种，每处理重复3次，并以未接拮抗菌的病原菌为对照，28℃恒温培养箱培养4 d后，观察并测定抑菌效果。

1.3 数据处理

使用MEGA5.0进行CLUSTAL X多重比对，使用NJ法构建系统发育树[8]，自举值为(Bootstrap) 为1 000。

2 结果与分析

2.1 根茎病害发病情况

达坂城蚕豆根茎病害主要表现为植株叶片自下向上逐渐变黄枯萎，病叶常扭折、弯曲，干枯脱落。病株茎基部有黑褐色病斑，稍凹陷，甚至干裂，茎基部病斑逐渐向上发展，致使茎上部分嫩尖倾斜或下垂，最后整个植株枯死。剖开病茎，病斑根据病害的等级由表皮逐渐向内部延伸。图1

根系受害时，侧根和主根上均产生褐色至黑褐色条纹，逐渐发展，可导致主根变黑，皮层腐烂，须根全部坏死并消失，且在此过程中根瘤逐渐减少、消失。病株根系弱小，极易拔出。图2

注：CK 健康植株；D1-D3不同发病程度的植株

Note: CK Healthy plants; D1-D3 Plants with different degrees of disease

图1 达坂城蚕豆植株病茎剖面
Fig.1 Stem profile of broad faba bean in Dabancheng

注：A-C 为2～4级发病情况的病株根茎部；D为2级发病植株的茎秆

Note:A-C the root and stem of faba bean of the 2-4 stage disease. D the stem of faba bean of the 2 stage disease

图2 达坂城蚕豆根茎病害情况
Fig.2 Root and stem diseases of faba bean in Dabancheng

研究表明，达坂城蚕豆根茎病害主要开始发病时期为6月上中旬，此时蚕豆为花期或接近开花期。调查6月22当日平均气温20℃(27℃ / 13℃，周平均气温20.2℃)，地头和进水区域病害发生较少，而农田中央或低洼积水处多发生，发病率最高约为4.0%；至7月后由于气温升高，田间湿度加大，植株发病率明显升高。至7月3日调查当时平均气温23℃(30℃ / 16℃，周平均气温21.5℃)调查最高可达到15.5%，病情指数升高2～3个级别，最高达到5级，部分植株开始枯萎死亡。表1

表1 达坂城蚕豆根茎病害调查
Table 1 Investigation and statistics on root and stem diseases of faba bean in Dabancheng

6月22日June22nd7月3日July3rd平均发病级别Averageincidencelevel发病率Morbidity(%)平均发病级别Averageincidencelevel发病指数Incidenceindex(%)备注Note低发病区域Lowincidencearea1级1.52级3.5地头进水区域高发病区域Highincidencearea2级4.04～5级15.5地中,低洼积水区域

2.2 根茎病害病原菌的分离与鉴定

经分离纯化，分别从达坂城蚕豆病害典型样本中，分离得到潜在病原菌5株，通过平板生长情况及菌落形态学特征观察，上述5株菌在PDA培养基28℃培养快速生长，菌落均突起絮状，菌落可高达3～5 mm，菌丝白色质密，培养后期由于大量孢子生成而呈粉质。镜栓观察，小型分生孢子着生于单生瓶梗上，常聚成球团，单胞，卵形；大型分生孢子为镰刀形，少许弯曲，多数为3隔，基本确定为一类菌。图3

图3 达坂城蚕豆根茎病害病原菌菌落形态
Fig.3 Colony morphology of fusarium wilt pathogen from Dabancheng faba bean

2.2.1 病原菌的分子鉴定

所得5株菌株分别提取菌体DNA，利用真菌ITS序列通用引物进行PCR扩增，经测序获得其ITS序列，并在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库上进行比对。通过在线比对，发现实验所获得的5株菌间ITS同源性为100%，均属于Fusarium属。进一步系统进化树构建表明，菌株与Fusariumchlamydosporumvar.fuscumCBS 635.76T在系统进化在同一枝，且具有最高相似性(99.8%)[9]。所得病原菌株极有可能为Fusariumchlamydosporumvar.fuscum。图4

2.2.2 病原菌致病性验证

将上述5株菌接种至健康的蚕豆茎秆上，并以未接菌的蚕豆茎秆为对照。观察发现实验分离的5株菌均具有相同的致病性，接种6 d后接种处开始呈棕色；10 d后发病病斑面积扩大，发病率均为100%，也进一步验证了实验所得的5株菌可能为同一致病株。 15 d病斑进一步扩大，病斑出现黑色部分表皮有略微凸起，经剖开皮层可以明显看到病斑向下扩展，并深入木质部，与实验采集的病株呈现症状相同，所得5株真菌为同一株蚕豆根茎病害病原菌。 图5

2.3 芽孢杆菌对蚕豆根茎腐烂病病原菌拮抗效果

拮抗菌的筛选采用平板对峙法进行。以分离到的病原菌为指示菌，接种于PDA平板中心，实验分别选用项目前期获得的芽孢杆菌B6和新疆神威生物股份有限公司提供的枯草芽孢杆菌B1进行拮抗实验验证。拮抗菌采用四点对峙法接种，每处理重复3次，并以未接拮抗菌的病原菌为对照，28℃恒温培养箱培养4 d后，观察并测定抑菌效果。两株菌均可对蚕豆病原菌起到有效抑制作用，其抑菌/菌落比可以达1.90以上,可作为蚕豆根茎病害的生物防治菌剂。图6

图4 基于真菌ITS序列建立的病原菌NJ系统进化树
Fig.4 NJ phylogenetic tree of pathogenic fungi based on ITS sequence

注：A为对照；B为对照10 d后剖面；C为接种病原菌10 d茎秆；D为接种10 d茎秆剖面

Note:A CK；B Longitudinal section of the CK stem 10 days later;C The stem was inoculated by pathogenic fungi for 10 days;D:Longitudinal section of the stem that it was inoculated by pathogenic fungi for 10 days

图5 蚕豆茎秆病原菌致病性验证
Fig.5 Verification of Pathogenicity of Pathogens on Vicia faba Stem

3 讨 论

蚕豆是典型的忌连作作物，连作造成土传根茎枯萎病严重发生，加大蚕豆间作可以有效降低该病害的发生；同时，蚕豆根茎枯萎病的发病也与蚕豆的品种、品系有关。我国的云南、江苏、浙江、青海、甘肃等省区均有蚕豆根茎枯萎病的报道[10-12]。现有研究表明，蚕豆根茎枯萎病主要由镰刀菌引起，已报道可引起蚕豆根茎枯萎病的镰刀菌包括锐顶镰刀菌(F.cuminatum)、尖孢镰孢(F.axysporum)、串珠镰孢(F.moniliforme)、F.moniliformevar.subglutinans、燕麦镰孢(F.avenaceum)、木贼镰孢(F.equiseti)、三线镰孢(F.tricinctum)、禾谷镰孢(F.graminearum)和茄镰孢(F.solani)[13-16]。新疆此前未见蚕豆根腐病报道，2009年达坂城地区逐渐出现该类病害，并到2015年才对病害进行报道，但一直未对真菌致病菌进行分离鉴定。

图6 芽孢杆菌B1对蚕豆根茎腐烂病病原菌抑制效果
Fig.6 Inhibitory effect of B1 against pathogen of faba bean root rot disease

研究对达坂城根茎病害的病原菌进行了分离，通过分子鉴定初步确定为厚孢镰孢菌变种(Fusariumchlamydosporumvar.fuscum)。厚孢镰孢菌(Fusariumchlamydosporum)作为植物病原菌，此前在禾本科作物如小麦、玉米的根腐、茎腐病中均有报道[17-19]，近年来研究发现，厚孢镰孢菌也是引起大豆、石榴、马唐(Digitariasanguinalis)、橄榄、香蕉、紫花苜蓿等作物根腐病害的主要病原菌之一，由此可见,厚孢镰孢菌可能是更多作物的病原菌。实验调查所在地种植的达坂城蚕豆，自2009年开始发现相关病害发生后，一直认为其病害可能与不当引进外地蚕豆品种有关，为了避免病害大面积发生，其种植模式的发生采取了轮作模式，如玉米、小麦、苜蓿等，但蚕豆根茎病害还是经常发生，其原因可能是该病原菌也能侵染轮作的其他作物，这一点还有待进一步论证。

蚕豆根茎腐烂病的防治可采用20%三唑酮乳油拌种，或75%百菌清可湿性粉剂拌种，苗期用50%多菌灵可湿性粉剂1 000倍液灌根，或用70%甲基硫菌灵可湿性粉剂800～1 500倍液+50%福美双可湿性粉剂600倍液喷雾等方式进行防治，达坂城蚕豆作为我区农产品地理标志登记产品，不适宜采用传统的化学药剂的防治，采用生物防治是理想的办法。前期分离的芽孢杆菌B6和新疆神威生物股份有限公司提供的枯草芽孢杆菌B1均对病原菌具有良好的抑制效果，但其田间施用效果和使用规范还需进行深入研究。

4 结 论

对新疆达坂城蚕豆根茎腐烂病病原菌进行了分离，获得潜在病原菌5株，形态学观察确定其均属于镰孢菌属，分子鉴定初步确定均为厚孢镰孢菌变种(Fusariumchlamydosporumvar.fuscum)。通过人工接种实验分离菌株至达坂城蚕豆茎秆观察发现，该菌株具有很强的侵染性，接种10 d 后观察，病斑发生率可达到100%，并且其发病症状与实际采样中茎秆病斑一致，实验获得菌株为蚕豆根茎腐烂病致病菌株。采用的芽孢杆菌B6和B1对病原菌具有较好抑菌效果，其抑菌/菌落比可以达1.90以上，可作为达坂城蚕豆根茎腐烂病生防菌。