微生物菌剂对鸡粪堆肥过程中氨气排放和微生物群落的影响

于 静，谷 洁，王小娟，郭红宏，王 佳，张凯煜，代晓霞，赵文雅

(西北农林科技大学 资源环境学院，陕西杨凌 712100)

作为畜禽养殖大国，2016年中国养殖业产生的畜禽粪便已达38亿t[1]，对其合理的处置利用已成为亟待解决的问题。好氧堆肥作为农业废弃物无害化处理和资源利用的重要方式，其本质是微生物对有机物进行矿质化和腐殖化，形成稳定的腐殖质类物质的过程[2]。然而，当前的堆肥过程中存在腐熟周期过长，处理不彻底等问题[3]，更为重要的是，堆制过程中会产生大量臭气，尤其是NH3的排放，这不仅造成堆肥产品中氮素的大量损失，而且严重污染环境[4]。

也有学者研究了微生物菌剂对堆肥过程微生物群落的影响，史龙翔等[11]在果树枝条堆肥中接种了复合菌剂，通过Biolog微平板法测定发现接种复合菌剂主要在高温期发挥作用，是通过改变微生物对6大类碳源的利用。解开治等[12]研究了由几种菌株复合的菌剂对猪粪堆肥过程中细菌群落的影响，用PCR-DGGE技术分析表明外源菌剂极大影响了各阶段细菌群落结构。目前对微生物菌剂的研究侧重于探究其在堆肥进程中的作用，对于微生物群落多样性影响的研究方法大多采用传统分子学生物手段。本试验接种了2种不同微生物菌剂于鸡粪好氧堆肥中，测定堆肥参数和NH3排放量的变化，利用高通量测序技术分析微生物群落结构，探究微生物菌剂的接种对堆肥过程中NH3排放的影响，揭示影响微生物群落变化的驱动因子，阐明微生物菌剂影响堆肥进程的生物学机制，提供了畜禽粪便无害化处理的理论依据。

1 材料与方法

1.1 堆肥材料与装置

本试验的堆肥材料为鸡粪，选自陕西杨凌某小型养鸡场，小麦秸秆采自农户小麦地，晾干粉碎均匀至1～2 cm长度用于调节堆体的C/N。堆肥物料的基本性质如表1。

试验所用2种菌剂，Tx菌剂为西北农林科技大学资源环境学院环境微生物研究团队自行筛选获得的WSD-5纤维素降解复合菌系，采用Mandels培养基[(NH4)2SO41.4 g/L， MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KH2PO42.0 g/L，蛋白胨 2.5 g/L， CaCO32.0 g/L，FeSO4·7H2O 5.0 mg/L， MnSO41.6 mg/L，ZnCl21.7 mg/L，CoCl 1.7 mg/L；1%(m/v)干燥的麦秆作为唯一碳源；pH 7.0]在30 ℃下以150 r/min的摇床培养7 d，使其菌液活菌数达到108CFU/mL用于接种。Tc菌剂选择了2种具有保氮功能的单菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，分别为松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，CGMCC菌株编号分别为1.108 76、1.187 0，将单菌活化后进行拮抗实验，然后分别选取生长状况较好的菌群进行扩大培养，按1∶1的体积比混合使其菌液活菌数达到108CFU/mL，用于接种。

表1 堆肥物料的基本性质Table 1 Basic characteristics of compost materials

堆肥试验在3个工作体积完全相同的130 L的密闭不锈钢反应器中进行。该反应器直径为0.51 m，高为0.75 m，筒壁外包有8 cm泡沫塑料和5 cm石棉布用于保温。该堆肥反应器设有3个孔，一个在反应器底部用于连接泵进行曝气，一个位于反应器中间用于堆体温度的测量，最后一个位于反应器顶部用于空气流出。

1.2 试验设计与方法

试验共设置3个处理，分别为不接种任何菌剂的对照处理(CK)，接种量为5%(质量分数)的Tx处理，以及接种量为5%(质量分数)的Tc处理。

将新鲜鸡粪与小麦秸秆按比例混合并调节C/N比至25左右，再根据试验处理分别接种Tx和Tc微生物菌剂，添加适当的去离子水使含水率控制在60%左右。在初始阶段将堆料混合均匀，各堆体质量为15 kg，最后装填在密闭的堆肥反应器中，保持堆肥通风速率为0.35 L/(h·kg)(干质量)[13]，试验在堆肥第3天翻堆1次，随后每 7 d翻堆1次，保证物料充分混匀。

1.3 样品采集与分析方法

堆肥试验持续44 d，依据堆肥过程中温度的变化，在堆肥第0、3、12、17、44天进行样品采集。采集时在堆体上、中、下部分别进行采集并混合均匀，每份样品均匀地分为两部分，一部分保存于 4 ℃冰箱，用于理化指标的分析，另一部分样品用于微生物测序，先用真空冷冻干燥机(北京松源，中国)冷冻干燥，再用超离心研磨仪(Retsch z200，德国)粉碎，在进行微生物试验前保存于 -80 ℃冰箱。

1.3.1 NH3和理化指标的测定 NH3的收集于每日8：00，经硼酸吸收后用标准H2SO4溶液滴定[14]。用温度计每日定点测量堆体及其环境温度并求取平均值。pH、含水率、总有机碳、总氮的具体测定方法参考土壤农化分析[15]，用pH计(Mettler Toledo，瑞士)对新鲜样品悬浮液(固 体∶水=1∶10，m/v)进行pH的测定；含水率在105 ℃下烘干8 h测定；总有机碳的测定采用重铬酸钾容量法，用凯氏定氮法完成对全氮的测定。种子发芽指数(GI)参照Zucconi等[16]方法，将鲜样按1∶10(m/v)浸提后，取5 mL于铺有滤纸的直径为9 cm的培养皿中，在其中均匀放置20粒颗粒饱满的小白菜种子，对照为5 mL蒸馏水，各处理重复3次，放到25 ℃培养箱培养48 h后对根长进行测量。种子发芽指数(GI)按下式计算：GI=(试验样种子发芽率×种子根长)/(对照种子发芽指数×对照样种子根长)×100%

1.3.2 16S高通量测序分析 将0.1 g堆肥样品使用Fast DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals，美国)进行DNA的提取，具体详细步骤参考说明书。利用Nanodrop Spectrophotometer ND-1000(Thermo Fisher Scientific，美国)检测DNA浓度和纯度，在确保样品浓度和纯度合格后，保存于-30 ℃冰箱。

将提取的DNA堆肥样品寄送至北京诺禾致源科技股份有限公司，进行16S rRNA基因V3-V4可变区高通量测序。通过UPARSE将序列在97%相似水平下进行聚类，获得可操作分类单元(OTUs)。利用QIIME进行抽平、RDP分类，得到样品OTUs详细的注释结果，进行后续 分析。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 19.0进行数据统计分析和方差分析(LSD，P<0.05)，采用Microsoft Excel 2016绘图。利用CANOCO 4.5软件进行冗余分析。

2 结果与分析

2.1 各处理堆肥过程中理化参数的变化

2.1.1 温度的变化 温度是堆肥进程的直观反映，如图1所示，该过程经历了快速升温、持续高温、降温和腐熟稳定4个阶段，各处理在堆肥第1天迅速升至55 ℃以上并维持了一定时间，达到了中国农业废弃物无害化处理标准(GB 7959-87)。具体来看，Tx和Tc处理于第1天达到60 ℃以上，并在55 ℃以上均维持了13 d；而CK处理升温较慢，于第3天开始升至60 ℃以上，并于55 ℃以上持续了11 d。各处理在第10天经翻堆后温度又回升至55 ℃以上，在堆肥15 d后，随着易降解有机质的连续减少[14]，各处理温度下降至平稳水平。

图1 不同堆肥处理温度的变化Fig.1 Changes in temperature of different treatments during composting

如图2-D所示，各处理全氮质量分数在整个堆肥过程中均逐渐增加。堆肥初期，CK、Tx和Tc处理全氮质量分数分别为1.46%、1.51%和1.35%，各处理间差异不显著(P>0.05)。直至堆肥结束，各处理测得的全氮质量分数分别增加到2.49%、3.11%和3.08%，Tx和Tc处理显著高于CK(P<0.05)。

2.1.3 堆肥过程中C/N和种子发芽指数(GI)的变化 C/N可看作一个较为直观的衡量堆肥腐熟的化学指标，CK、Tx、Tc处理的C/N在堆肥过程中均逐渐下降(图3-A)，分别由25.49、22.96、27.97下降至12.14、10.05、11.39。这是微生物利用消耗有机碳、全氮质量分数相对增加的结果。研究表明堆肥结束时的C/N为10～14，可表明堆肥已腐熟完全[19]。有学者采用T=(终点 C/N)/(初始C/N)来衡量堆肥腐熟度，当T<0.6时可认为其达到腐熟标准[20]。在本试验的3个处理中，T值分别为0.48、0.44、0.41。

如图3-B所示，各处理的种子发芽指数(GI)在整个堆肥进程中均为增长趋势。在堆肥初期，GI较低，为27.8%～31.9%，堆肥结束时，各处理的GI分别达到93.1%、117.0%、146.3%。GI作为生物指标常用作评价堆肥腐熟度，当GI>60%时，可认为其不具有植物毒性，即堆肥已达到腐熟[21]，说明经过44 d堆肥，堆肥产品均达到无害化程度。

图2 不同堆肥处理中和全氮的变化Fig.2 Changes in and total nitrogen during the composting of different treatments

图3 不同堆肥处理中C/N和GI的变化Fig.3 Changes in C/N and GI during the composting of different treatments

2.2 堆肥过程中NH3的排放

堆肥过程中各处理的NH3排放量和积累量如图4所示。从图4-A可以看出，堆肥过程中NH3排放的峰值集中在高温阶段，即前10 d，在各处理中分别占总排放量的79.5%、75.4%和83.0%，并在第10 天翻堆后又出现回升，随后逐渐减弱。CK、Tx、Tc处理NH3的排放量分别在第6、6、5天达到最大值，分别为1.868、1.575和1.285 g/d。图4-B显示了堆肥过程中NH3的累积排放量，CK、Tx、Tc处理NH3的累积排放量分别达到12.7、9.4和8.4 g/d，Tx和Tc处理与对照相比分别降低28.9%和34.1%。

图4 不同堆肥处理NH3的排放量和累积排放量的变化Fig.4 Changes in emissions and acumulative emissions of NH3 of different treatments during composting

2.3 堆肥过程中微生物群落结构变化

如图5所示，细菌群落在门水平上表现出较大的变化。在13个样品中，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和软壁菌门(Tenericutes)是鸡粪好氧堆肥过程中主要的门类水平类群，占总细菌数的93.3%～99.4%。厚壁菌门在堆肥高温期一直占主导地位，随着温度下降其丰度逐渐降低。变形菌门、放线菌门和绿弯菌门的相对丰度在降温期和腐熟期明显增高，分别比堆肥第0天升高了2.66～3.85、1.30～1.87和66.3～111.6倍。

图5 堆肥过程中主要门水平细菌相对丰度的变化Fig.5 Changes in relative abundance of bacteria at main phylum levels during composting

将细菌群落相对丰度(基于门水平)和温度、pH、硝氨态氮、全氮(TN)、C/N、GI、NH3进行冗余分析(图6)，对细菌群落和环境因子之间的关系进行探究。结果显示选取的环境因子共解释了细菌群落变化的90.9%，RD1轴解释了84.8%，RD2轴解释了6.1%。在所选的变量中温度和pH的解释度最高，分别为20.34%和17.51%，表明温度和pH是鸡粪堆肥过程中不同处理间细菌群落差异的主要驱动因子。

从表2可以看出，温度对主要的6大菌门均呈显著相关性(P<0.01)，pH对于变形菌门、放线菌门及绿弯菌门呈显著正相关，而对厚壁菌门呈显著负相关(P<0.01)。厚壁菌门和变形菌门均与氮元素的转化有显著的相关性(P<0.05)。

表2 微生物菌剂对鸡粪堆肥过程中理化性质与门水平微生物的Spearman相关系数Table 2 Spearman’s correlation coefficients between physicochemical properties and dominant bacterial phyla during chicken manure composting

注：* 相关系数在0.05水平(双侧)上显著相关。** 相关系数在0.01水平(双侧)上显著相关。

Note: * Correlation coefficient was significantly correlated at 0.05 level (bilateral). ** Correlation coefficient was significantly correlated at 0.01 level (bilateral).

图6 堆肥过程中不同处理环境因子对细菌群落结构的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis between environmental factors and bacterial community structure by different treatment during composting

3 讨 论

好氧堆肥是处理养殖场废弃物主要方式，但当前堆肥腐熟周期较长，堆制过程中会产生大量NH3而造成养分损失，其臭味也会带来环境二次污染等问题[22]。通过外源接种微生物菌剂可以加速堆肥进程或减少有害气体的排放[23-25]。因此本试验在鸡粪堆肥过程中分别接种Tx和Tc 2种微生物菌剂，探究其对堆肥过程中NH3排放的影响及不同理化因子和微生物群落之间的相 关性。

通过对鸡粪堆肥过程中不同处理进行门水平细菌群落结构分析，发现堆肥过程中细菌群落是不断演化的，堆肥过程中主要的门类与Qian等[40]的研究一致。堆肥初始阶段，厚壁菌门丰度最高(52.5%)，经高温期增加后，在降温期逐渐下降腐熟期降至最低。有研究表明厚壁菌门成为堆肥高温期的优势菌门可能与厚壁菌门的内孢子具有耐热性有关[41]，可以对抗外界的恶劣环境。还有研究表明，厚壁菌门对促进纤维素的降解和利用起着特殊的作用[42]。而变形菌门和放线菌门在降温期和腐熟期占据主导地位成为优势菌群，这与殷亚楠[43]研究结果一致。放线菌门的相对丰度在堆肥过程中逐渐增加并于堆肥结束时保持稳定，研究表明堆肥过程中放线菌门的大量出现是堆肥腐熟的标志之一[44]。与此同时，拟杆菌门的相对丰度也逐渐增加，这种门主要存在于堆肥成熟期，被认为是专门降解高分子量化合物的细菌[45-46]。在堆肥结束时，Tx和Tc处理的拟杆菌门相对丰度分别较CK高2.96和2.82倍，这可能是接种微生物菌剂的处理腐熟程度高的原因。

4 结 论

本试验研究了接种2种不同的微生物菌剂对鸡粪堆肥过程中基本理化参数、NH3排放和微生物群落的影响。结果表明，堆肥中接种Tx和Tc微生物菌剂均可以加速堆体升温，使得高温期延长，提高堆肥的腐熟度。Tx和Tc微生物菌剂均对鸡粪堆肥过程中NH3排放有一定的抑制作用，还能增加堆肥产品的全氮，Tc微生物菌剂对NH3的控制效果更好，具有较好的除臭保氮效果。接种微生物菌剂会对微生物群落结构和组成产生影响，冗余分析结果表明，温度和pH是影响微生物群落结构变化的主要驱动因子。厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)在氮素的转化和释放过程中发挥着重要作用，今后可以对其相关的功能微生物进行深入研究，以期减少氮素的损失，进而生产高质量的堆肥产品。