白鲜皮提取物对红细胞氧化损伤的抑制作用

兰玉艳 李岩

(北华大学医学院，吉林 吉林 132013)

白鲜皮又称白藓皮是一种常用的中草药〔1〕，其为芸香科白鲜属植物白鲜的根皮〔2〕，主产于东北、华北、西北、西南等地〔3〕。研究发现，白鲜皮的主要化学成分有白鲜碱、倍半萜、倍半萜甙类化合物、黄酮类化合物、柠檬苦素类化合物、多糖和甾体类化合物等〔4〕，不但具有消炎、杀菌、除虫、抗非特异性变态反应、治疗湿疹等功效，还在抗肿瘤方面发挥重要作用〔5〕。现阶段白鲜皮对红细胞氧化损伤具有保护作用的研究尚未见报道，因此，本实验以白鲜皮乙醇提取物(AEDP)为受试药物，以红细胞自氧化溶血和过氧化氢(H2O2)引起氧化溶血为研究模型，通过对人红细胞自氧化溶血度和H2O2所致红细胞溶血度的测定，探讨其对红细胞的抗氧化作用，并对其抗氧化活性成分进行定性分析。

1 材料与方法

1.1药物制备 野生白鲜皮于2013年9月采自吉林省敦化市雁鸣湖自然保护区，自然荫干后粉碎，水煮醇沉、大孔树脂吸附等处理得到AEDP。

1.2主要仪器、试剂 LD5-100型离心机，北京医用离心机厂；XSS250(FZ)型深部X线治疗机，温州大华仪器仪表有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；722型光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂。肝素钠10% NaOH，长春市化学试剂。

1.31%人红细胞悬液的制备〔6〕取健康成人静脉血2 ml加入肝素抗凝。用pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，1 500 r/min，离心10 min。用相同的PBS配成1%红细胞悬液置于4℃冰箱保存，待用。

1.4人红细胞溶血度的测定 取1%人红细胞悬液，加入预先配置好的不同浓度的AEDP，分别以恒温水浴箱孵育24 h和H2O2诱导为损伤因素，用比色法测定红细胞溶血度。

1.6H2O2所致红细胞溶血度的测定 分成空白组、对照组、AEDP各剂量组。空白组3 ml 1%红细胞悬液加入250 μl PBS；对照组3 ml 1%红细胞悬液加入200 μl PBS 和50 μl 30%H2O2；实验组3 ml 1%红细胞悬液加入200 μl PBS配制的含有不同浓度AEDP(12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/ml)和50 μl 30% H2O2。充分混匀后，将空白组、对照组、各实验组试管同时置于37℃恒温水浴1 h，1 500 r/min，离心10 min。722型分光光度计，455 nm波长测定吸光度，视对照组为100%溶血，计算溶血度。每次实验设6个平行管且重复6次。

1.7统计学方法 采用SPSS16.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1人红细胞自氧化溶血度测定的结果 对照组和AEDP各剂量组均出现了不同程度的溶血现象，AEDP各剂量组红细胞溶血度显著低于对照组(P<0.05)。见表1。AEDP对红细胞自氧化溶血有明显的抑制作用，且随着剂量的增加，红细胞溶血度逐渐降低，提示AEDP与红细胞自氧化溶血度可能存在一定的剂量-反应关系。

表1 各组红细胞自氧化吸光度及溶血程度比较

与对照组比较：1)P<0.05；表2同

2.2H2O2所致人红细胞溶血度的测定结果 空白组、对照组、AEDP各剂量组红细胞溶血现象显著，AEDP各剂量组红细胞溶血度显著低于对照组(P<0.05)，见表2。AEDP对H2O2所致红细胞溶血有明显的抑制作用，且随着剂量的增加，红细胞溶血度逐渐降低，提示AEDP与H2O2所致红细胞的溶血度可能存在一定的剂量-反应关系。

表2 各组H2O2所致红细胞氧化吸光度及溶血度的测定

3 讨 论

红细胞是血液中数量最多的一种血细胞，同时也是气体交换的主要媒介，同时还具有免疫功能，红细胞膜上含有大量的不饱和脂肪酸，大量研究表明这些不饱和脂肪酸最易受到自由基、活性氧(ROS)或活性氮(RON)的攻击，而发生脂质过氧化反应〔7，8〕。脂质过氧化〔9，10〕不仅破坏红细胞膜脂质，从而使红细胞膜完整性发生改变，导致其溶血；还可与邻近的分子如膜蛋白质反应，或扩散至细胞核与DNA反应〔11～13〕。而H2O2本身就是一种强氧化剂，是细胞氧化应激，应激原ROS家族中的一员〔14〕。生理状态下，ROS和RON是机体维持多种生理功能的物质基础。然而，当机体暴露毒物时会导致机体抗氧化的能力减弱从而引起机体清除自由基、ROS或RON的能力减弱，导致机体内产生过量的自由基、ROS或RON破坏了机体的氧化、还原的正常平衡，导致机体组织和细胞发生氧化应激〔15，16〕。氧化应激是真核细胞的一种保护性应激反应。氧化应激的早期，机体通过启动细胞内抗氧化防御系统，清除过量的自由基，使细胞免于氧化性损伤。然而，氧化应激通常具有细胞应激特有的两重性：即随着氧化应激反应的持续，机体在清除过量的自由基、ROS或RON的同时，有可能导致细胞调节功能和细胞维持功能的障碍，甚至引起细胞的凋亡和自噬。所以，当红细胞处于充足的氧环境和大量H2O2存在的情况下，容易发生脂质过氧化反应，产生溶血现象〔17，18〕。可见避免过量的自由基、ROS或RON产生就可抑制脂质过氧化反应，抑制红细胞溶血，保护红细胞膜的完整性。

本实验提示H2O2可能破坏红细胞膜的完整性，导致红细胞溶血现象的发生；AEDP对H2O2所致红细胞溶血有明显的抑制作用；H2O2所致人红细胞的溶血度与AEDP可能存在一定的剂量-反应关系，表明AEDP对红细胞氧化损伤具有保护作用，防止红细胞发生溶血现象。

综上，AEDP对体外红细胞氧化损伤的保护作用可能是机体通过启动细胞内抗氧化防御系统，清除机体内过量的自由基、ROS或RON等，抑制脂质过氧化反应，防止红细胞溶血现象，保护红细胞膜的完整性，使细胞免于氧化性损伤〔13，19，20〕。