早期恐惧声音应激对大鼠远期学习记忆能力及海马CA1区5-HT1AR-CREB-BDNF信号通路的影响

孙缦利 邓海峰 王兴红

(漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462000)

心理应激是机体在某种环境刺激作用下由于客观要求和应付能力不平衡而发生的心理生理功能改变的过程。心理应激的产生可提高机体的警觉水平，应付各种环境变化的挑战，但长时间的应激状态则会损害心身健康〔1〕，儿童的心理状态处于不稳定的易变期，早期创伤性心理应激事件(如母爱剥夺、家庭变异、受虐、恐怖影像、自然灾害等)对成年后的认知能力、学习记忆、精神状态等往往有较深远的影响〔2〕。更好地了解童年期心理创伤及创伤后应激障碍的相关问题，有助于进一步认识心理创伤带来的影响，理智对待创伤后应激障碍。研究报道，心理应激能够损伤动物空间学习和记忆能力〔3〕；另有研究表明，5-羟色胺1A受体(HT1AR)-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)-脑源性神经营养因子(BDNF)信号通路和动物的认知情况密切相关〔4〕。本研究拟探讨婴幼儿期心理应激与成年后学习记忆的关系及其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 兔抗鼠5-HT1AR、CREB和BDNF多克隆抗体均购自Abcam公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒均购自碧云天生物技术公司；Morris水迷宫装置由中国医学科学院药物研究所研制。

1.2实验动物及分组 10只健康SD孕鼠，清洁级，体质量(230±10)g，购于河南省实验动物中心(动物合格证编号：SCXK豫 2014-0002)，所有动物在自然光暗周期的环境中饲养，自由觅食、饮水。10只孕鼠随机分为对照组和应激组各5只，待其生产后每组各选择20只雄性仔鼠进行实验研究。参照Hu等〔5〕的方法，应激组的雄性仔鼠于出生后第1天开始接受恐惧声音应激，强度为65～85 dB，每天上、下午各播放2 h，应激后放回原笼置于正常环境下饲养，应激持续21 d。对照组雄性仔鼠出生后于正常环境下饲养。两组仔鼠均于出生后第21天断乳，然后自由进食、饮水。应激结束后5 w行Morris水迷宫实验检测学习记忆能力。

1.3Morris水迷宫实验检测学习记忆能力 Morris水迷宫水池中加入适量的墨汁，使水池成为不透明色(去除视觉干扰)。在圆桶的上缘等距离地设东、南、西、北4个标记点作为进水点，以这4个入水点在水面和水桶底部的投影点将水面和水桶部分均等地分为4个象限。将平台放置于第3象限的中间，水温保持在22～23℃。

1.3.1大鼠训练 训练时，将大鼠面向池壁从4个入水点分别放入水池，记录从入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间，作为潜伏期。找到平台后，让其在平台上站立60 s。若入水后120 s未能找到平台，则将其轻轻从水中拖上平台，并停留10 s，然后进行下一次训练。每只大鼠从4个入水点分别放入水池为一次训练，两次训练之间间隔30 s，用纸巾将其擦干净。

1.3.2定位航行试验 观察和记录大鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间，即记录其潜伏期，历时4 d，上下午各训练4次(各个象限)，记录其潜伏期，上台后休息60 s，继续下一个象限训练。用于测量对水迷宫学习和记忆的获取能力。

1.3.3空间搜索试验 定位航行试验结束后去除平台，从同一个入水点放入水中，测其第一次到达原平台位置的时间、120 s内穿环次数。用于测量学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力。

1.4HE染色观察海马CA1区的病理情况 Morris水迷宫实验结束后，每组随机选取4只大鼠，0.8%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，0.9%生理盐水做心脏灌流5 min，然后4%多聚甲醛灌流固定约10 min，断头取出脑组织，4%多聚甲醛中室温固定至少6 h，酒精梯度脱水(各10 min)，二甲苯透明和石蜡包埋，冠状面切片，切片厚度为5 μm，烤片，贴片，HE染色2～3 min，酒精脱水，再经二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察病理学变化。

1.5免疫荧光组织化学法检测海马CA1区5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表达 每组各取8只大鼠，0.8%戊巴比妥钠麻醉，经4%多聚甲醛心脏灌流，用徕卡冰冻切片机对灌流固定好的组织进行冠状面切片，厚度为30 μm。所得切片置于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min×3次。用0.3% Triton X-100破膜处理2 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，10%牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h，加入一抗(兔多克隆抗体5-HT1AR，1∶500；兔多克隆抗体CREB，1∶300；兔多克隆抗体BDNF，1∶500)4℃孵育48 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，用FITC标记山羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育2 h，0.01 mol/L PBS 洗5 min×3次，90%甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察、拍照。每只大鼠随机选取5张非连续切片，采用Image pro plus6.0图像处理软件测定其积分光密度值(IOD)。

1.6Western印迹法检测海马5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表达 每组各取8只，0.8%戊巴比妥钠麻醉，经4%多聚甲醛心脏灌流，快速取出全脑，冰浴分离出海马，按1 g∶10 ml的比例加入全细胞裂解液，组织经匀浆、超声破碎后，用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转硝酸纤维素(NC)膜，10%脱脂牛奶封闭NC膜1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，然后室温下与兔抗鼠一抗5-HT1AR(1∶1 000)、CREB(1∶1 000)、BDNF(1∶1 000)杂交反应2 h，TBST漂洗同前，再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗IgG(1∶3 000)杂交反应1 h，TBST漂洗同前，加入电化学发光试剂反应5 min，保鲜膜包裹，暗室进行X线胶片曝光、显影和定影。然后同一张NC膜再与β-肌动蛋白(actin)(1∶1 000)进行杂交反应。Western印迹条带经凝胶成像分析系统扫描处理，计算单位光密度值和条带面积，将各实验点的总光密度值与对照组比较，得到相对百分数。

1.7统计学处理 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1学习记忆能力检测结果 与对照组相比，应激组大鼠逃避潜伏期和第1次到达原平台位置的时间明显延长(P<0.001)，穿环次数明显减少(P<0.001)。见表1。

2.2海马CA1区HE染色结果 对照组海马区神经元结构整齐、排列紧密，而应激组海马区的神经元排列疏松紊乱，并且出现了神经元丢失。见图1。

2.3两组海马CA1区5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表达比较 被标记上绿色或黄色的为阳性细胞。

免疫荧光组化结果表明，对照组海马CA1区5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白阳性表达较多，染色较强，而应激组海马CA1区5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白阳性表达明显减少(P<0.001)，染色较弱。见图2，表2。与对照组相比，应激组海马CA1区的5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表达均明显降低(P<0.001)，见表2，图3。

表1 各组水迷宫、跳台实验结果比较

图1 两组海马CA1区的形态(HE染色，×400)

图2 两组海马CA1区5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表达(HE染色，×400)

组别免疫荧光组织化学(IOD)5-HT1ARCREBBDNFWestern印迹5-HT1AR/β-actinCREB/β-actinBDNF/β-actin对照组0.62±0.030.43±0.020.75±0.050.99±0.221.08±0.260.93±0.20应激组0.47±0.020.28±0.010.61±0.030.42±0.150.31±0.130.40±0.14t/P值11.770/<0.00118.970/<0.0016.791/<0.0016.119/<0.0017.492/<0.0016.140/<0.001

图3 两组海马5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白的表达

3 讨 论

心理应激动物模型的造模方法常见的有足底电机、睡眠剥夺、强迫游泳等，但这些造模方法大都包括躯体应激和心理应激两种影响因素。以大鼠恐惧的声音为应激源对其持续应激所建立的恐惧声音应激模型是一种简单易行、较为纯粹的心理应激模型。Morris水迷宫是检测动物学习记忆能力的一种经典方法，而对学习记忆能力的检测是对心理应激水平评估的一项重要指标〔6〕。婴幼儿期是神经发育最迅速的时期，此时各种应激极易导致神经可塑性变化，从而影响后期的认知发展和运动功能〔7〕。本研究结果显示，早期恐惧声音应激可以降低其成年后的学习记忆能力，这与之前报道一致〔8〕。提示对恐惧声音应激模型的处理是成功的。

海马是学习记忆发生、改变的关键脑区，应激时海马尤其是CA1区结构极易受损而发生可塑性变化，从而影响学习记忆功能〔9〕。本实验表明早期恐惧声音应激可以导致海马CA1区形态结构发生病理学改变。5-HT是中枢神经系统中与学习和记忆密切相关的递质，其作用是通过5-HT受体中介〔10〕，可以调节突触递质释放、改变突触传递效率、调控神经损伤后修复能力。5-HT受体有很多亚型，其中5-HT1AR集中于大脑皮质及边缘叶等与记忆功能密切相关的脑区，其活性与人类的认知功能息息相关，是介导5-HT系统发挥其调控神经功能的重要受体〔11〕。研究报道，增强海马5-HT1AR介导的神经信息传递，可提高海马功能和抵御应激性损伤的能力〔12〕。由此分析早期恐惧声音应激导致的海马CA1区病理学改变可能和5-HT1AR活性有关。5-HT1AR并非直接影响学习记忆能力，其表达发生变化后，引起下游分子发生相应变化，才能进一步影响突触可塑性，最终影响学习记忆〔13〕。

CREB是一种重要的参与学习记忆功能的核转录因子，也是5-HT1AR介导的信号通路下游的重要分子之一〔14〕。5-HT1AR通过G蛋白耦联调控cAMP酶活性，进而调控CREB活性。CREB活性受到抑制后会引发中枢内多种神经营养因子的表达下降，从而降低突触可塑性、抑制长时程增强(LTP)〔15〕。本研究提示CREB表达下调可能参与了早期恐惧声音应激导致的学习记忆能力降低。

BDNF是一种重要的神经营养因子，广泛地表达于大脑皮层、海马、下丘脑等中枢神经系统，参与神经元的分化、发育和神经元损伤后的修复与再生，同时其表达下调可降低突触传递效率和突触可塑性〔16〕。本实验提示BDNF表达下调可能参与了早期恐惧声音应激导致的学习记忆能力降低。

基于以上研究报道和本次实验结果，分析早期恐惧声音应激导致大鼠成年后的学习记忆能力下降可能和海马CA1区5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表达变化有关，其机制可能是早期恐惧声音应激首先导致海马CA1区5-HT1AR表达下降，进而通过抑制cAMP酶活性下调CREB表达，CREB表达下调进一步使BDNF表达降低，由于BDNF表达降低可导致突触传递效率下降，产生长时程抑制效应，最终引发学习记忆障碍，但具体机制还需深入探究。

综上，早期恐惧声音应激可能通过下调5-HT1AR-CREB-BDNF信号通路，使大鼠学习记忆能力下降。即婴幼儿期遭受过度心理应激可影响成年后的认知能力，因此为了保护婴幼儿健康身心发展，除了采取措施避免其遭受过度应激外，还要在其遭受应激后尽早采取措施以预防更严重的后果出现。