新疆汉族老年人轻度认知功能障碍患者维生素D受体基因多态性与血清25(OH)D水平的相关性

帕力达·阿不力孜 卡比努尔·克依木 祖力菲亚·阿吉木 周晓辉

(1新疆医科大学第一附属医院老年病科,新疆 乌鲁木齐 830011；2新疆维吾尔自治区人民医院)

Reisberg等〔1〕1982年首次提出轻度认知功能障碍(MCI)的概念。MCI的特征是记忆损坏，它介于正常老龄化与轻度痴呆之间，无法被其他精神系统类疾病解释。目前关于MCI影响因素的研究受到国内、外研究者的关注。其中维生素D的水平及维生素D受体(VDR)基因多态性在MCI发生发展中的作用已成为近期研究的热点。研究显示，维生素D缺乏伴随认知功能障碍是在老年人中普遍存在的现象〔2〕。也有研究者表明，VDR相关蛋白的基因多态性与MCI的发病存在关联性，BsmI、ApaI等基因位点出现的频率在AD组显著高于对照组。因此本文对VDR相关蛋白基因ApaI、BsmI两个位点的基因型及等位基因频率在汉族老年MCI患者中的分布及其与血清25(OH)D水平的相关性进行研究。

1 资料与方法

1.1研究对象 在2010年7月至2014年7月对新疆维、汉两民族老年人进行了MCI流行病学调查的基础上，采用美国精神病学会的精神障碍和统计手册第四修订版(DSM-Ⅳ)的MCI诊断标准，共入选汉族MCI组100例(女57例，男43例)，平均年龄 (77.22±6.59)岁。选取对照组145例(女70例，男75例)，平均年龄(76.72±5.71)岁。所有研究对象经受试者同意，并签署知情同意书，本实验已经通过新疆医科大学伦理委员会的审批同意。

1.2内容与方法

1.2.1MCI组纳入标准 (1)年龄：大于60岁；(2)符合美国精神病学会的精神障碍诊断和统计手册的第四次修订版(DSM-Ⅳ)的MCI诊断标准。①主观感觉有记忆减退；②客观检查有MCI的相关证据，如简易精神状态量表(MMSE)评分中学文化程度评分25～27分，小学文化程度评分21～24分，文盲评分18～21分，或总体衰退量表(GDS)评分为2～3级；③一般日常生活能力(ADL)及社会功能下降，ADL评分<26分；④Hachinski缺血量表评分≤4分，并且排除抑郁及其他特定原因引起的认知功能损害；⑤病程大于3个月；⑥未达到痴呆的诊断标准〔临床痴呆量表(CDR)=0.5分〕，严格按照上述诊断标准，共入选MCI患者100例。

1.2.2对照组入选标准 经严格的量表测评后，不符合美国精神病学会的精神障碍诊断和统计手册的第四次修订版(DSM-Ⅳ)的MCI诊断标准。选取与上述MCI患者有着相同或相近的生活背景，年龄、性别相匹配的非MCI者145例为对照组。

1.2.3排除标准 MCI组及非MCI组均应排除以下情况：①患有严重精神疾病者或先天精神发育迟滞者，如精神分裂症、抑郁症等；②患有严重心、肺、肝、肾等器官功能障碍，重度内分泌功能损害、重度感染性疾病、中毒性脑病的患者；③患有脑卒中、帕金森病、缺血性脑血管病、脑肿瘤等能够引起脑功能障碍的神经系统疾病的患者；④有重度头部外伤史者，过去半年内确定为酒精依赖或药物依赖者；⑤因各种原因无法配合认知功能检查者，如低文化、高龄或其他因素。被调查者存在上述情况之一者，即被排除。

1.2.4相关定义 ①高血压：因在流行病学调查中只能测一次血压，所以所有受试者未使用降压药物的情况下，收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压>90 mmHg；或既往确诊高血压病史目前正在服用降压药物者。②糖代谢紊乱：在流行病学调查中，因只能查空腹血糖(FPG)，因此FPG≥7.0 mmol/L；或既往确诊糖尿病病史目前正在服用降糖药物者。

1.2.5实验方法

1.2.5.1一般资料采集 采用现场问卷调查与入户调查相结合的方式，首先初步完成调查问卷，MMSE测定，对于主诉及家属诉其近期有明显记忆障碍及MMSE量表低于界值者，进一步进行临床体格检查，总体衰退量表(GDS)、汉密尔顿抑郁量表(HAMD)、Hachinski缺血指数量表(HIS)、CDR等检测，同时釆集患者基本资料，包括：身高、体重、血压、年龄、性别、文化程度、既往病史等一般资料。

1.2.5.2血标本采集 所有受试者晨间空腹、早上10∶00～12∶00采集静脉血5 ml，1 h内完成分离血清并转盛在EP管中-80℃科研冰箱中保存待检。

1.2.5.3DNA提取 所有受试对象采用外周血EDTA抗凝血5 ml，按外周血基因组DNA提取试剂盒(北京天根)说明书提取基因组DNA。应用SNaPshot法分别检测rs7975232和rs1544410的基因型。PCR反应体系20 μl 1×GC缓冲液Ⅰ，3.0 mmol Mg2+，0.3 mmol dNTP 1U Hotstar Taq多聚酶(德国Qiagen公司)，1 μl样本DNA和2 μl多重PCR引物(1～2 μmol)。引物的选择：rs 7975232正义链：5′-GAGAAGAAGGCACAGGAGCTCTCA-3′，rs7985232反义链：5′-TGGTATCACCGGT CAGCAGTCA-3′，rs1544410正义链：5′-TCACTGCACATTGCCTCCAAAA-3′，rs1544410反义链：5′-TTCGTAGGGGGG ATTCTGAGGA-3′。

1.2.5.425(OH)D 测定 应用酶联免疫吸附试验检测血清25(OH)D水平，仪器来自新疆医科大学第一附属医院检验科，具体操作按上海朗顿生物技术有限公司所提供的25(OH)D试剂盒说明。

1.3统计分析 使用SPSS17.0统计软件进行t及χ2检验。用Hardy-Weinberg对MCI组和对照组中两个位点的3个基因型数据进行检测。

2 结 果

2.1MCI组和对照组一般资料比较 MCI组和对照组在性别，是否患有糖尿病、高血压、年龄、体重、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、三酰甘油(TG)、FPG、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 MCI组和对照组一般资料比较

2.2VDR基因型分析结果 运用GeneMapper 4.1(Applied Biosystems Co.Ltd.USA)进行VDR基因SNP分型。图1为多重PCR焦电泳峰图，图中标注VDR基因BsmI(rs1544410)，ApaI(rs7975232)两个位点的三种基因型图，峰上标定的等位基因(如采用的延伸引物是正方向，则它跟延伸加入的碱基相同，如采用的延伸引物是反方向，则跟延伸加入的碱基是互补的)。SE，SR依次代表正方向或反方向的延伸引物，BsmI位点，延伸引物为rs1544410SE，为正向延伸引物，电泳峰图上用CT表示，Pos.C：43.31；T：45.11。ApaI位点，延伸引物为rs7975232SR，延伸引物是反向的，用GT表示，Pos.G：63.33；T：64.66。图1为ApaI，BsmI位点杂合突变的，基因型标在相应的峰顶。

图1 VDR基因型分析结果ApaI(rs7975232)与BsmI(rs1544410)杂合突变型

2.3Hardy-Weinberg 平衡检验 MCI组和对照组两个位点三种基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，符合遗传平衡定律。

2.4VDR基因ApaI位点多态性在MCI组和对照组间分布比较 ApaI位点基因型频率分布，MCI组与对照组CC基因型、CA基因型、AA基因型比较差异有统计学意义(均P<0.05)。携带AA基因型较CC基因型发生MCI的风险升高9.121倍(OR=9.121，95%CI：3.712～22.412，P=0.001)。A等位基因分布MCI组明显高于对照组(等位基因分布MCI组明显低于对照组)，等位基因频率在MCI组与对照组之间分布差异有统计学意义(P<0.05)，携带A等位基因较C等位基因发生MCI的风险升高1.872倍(OR=1.872，95%CI：1.272～2.755，P=0.001)。见表2。

表2 MCI组与对照组VDR ApaI位点基因型及等位基因频率分布的比较〔n(%)〕

2.5VDR基因BsmI位点多态性在MCI组和对照组间分布比较 BsmI位点多态性在两组间的分布，三种基因型、CT、TT，在MCI组与对照组中的频率分布比较差异有统计学意义(P<0.05)，MCI组和对照组间均以CC基因型最高，TT基因型最少，且CT基因型在MCI组中较对照组高，携带CT基因型较CC基因型发生MCI的风险升高2.857倍(OR=2.857，95%CI：1.208～6.758，P=0.014)。等位基因频率在两组间的分布，可见等位基因T在MCI组较对照组明显增高(P<0.05)，携带T等位基因较C等位基因发生MCI的风险升高2.206倍(OR=2.206，95%CI：1.001～4.859，P=0.045)。见表3。

表3 MCI组与对照组VDR BsmI位点基因型及等位基因频率分布的比较〔n(%)〕

2.6MCI组及对照组血清25(OH)D水平比较 MCI组血清25(OH)D水平为(60.19±31.73)ng/ml，明显低于对照组〔(70.50±37.50)ng/ml〕，两组间比较差异有统计学意义(t=-2.24，P=0.015)。

2.7MCI组VDR基因ApaI、BsmI位点多态性不同基因型与维生素D水平的比较 MCI患者VDR基因ApaI位点CC基因型血清25(OD)D水平为(80.82±34.37)ng/ml，CA+AA基因型血清25(OH)D水平为(73.58±31.95)ng/ml；BsmI位点CC基因型血清25(OD)D水平为(59.36±33.06)ng/ml，CT+TT基因型血清25(OH)D水平为(64.58±23.96)ng/ml。MCI组中，VDR基因ApaI(t=-1.039,P=0.301)、BsmI(t=-0.60,P=0.54)位点不同基因型比较血清25(OH)D水平差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

最新研究提示〔3〕，国内MCI患病率达20.8%，主要以遗忘型MCI最多见，与健康老年人相比，MCI患者罹患痴呆的风险高2.8～4倍。周晓辉等〔4〕对新疆南疆、东疆及乌鲁木齐等地区60岁以上维吾尔族、汉族两民族行MCI患病率调查结果显示：新疆汉族老年人MCI标化患病率为10.86%。流行病学调查显示〔3〕：有10%～15%的MCI患者会进展为痴呆。痴呆为患者、家庭及社会带来沉重的健康问题和经济负担，随着我国老龄化加剧，痴呆的早期诊断及干预已成为痴呆防治的主要问题和难点，而对MCI的识别和干预就是其中的研究重点之一。

目前国内关于维生素D与认知功能障碍关系的报道较少，有研究显示，维生素D缺乏的老年人整体认知功能衰退的风险更高，维生素D缺乏可能是阿尔茨海默病(AD)的重要发病机制之一〔5〕。Annweiler等〔6〕系统综述和Meta分析结果：与认知健康对照组相比，AD组血清25(OH)D浓度降低1.4倍标准差单位(P=0.016)。Annweiler等〔7〕对妇女膳食维生素D摄入量7年内AD发生研究发现摄入较高剂量维生素D的老年妇女，发生的AD的风险较低。本研究对100名新疆老年汉族MCI患者以及145名对照组进行调查，结果显示老年MCI组维生素D水平低于对照组，与上述研究结果结论一致。维生素D水平的下降可能在MCI患者中扮演着重要的角色，初步揭示维生素D缺乏老年人更易患MCI。

首先，维生素D可能通过自身免疫系统来激活患者体内吞噬细胞的清除及吞噬作用，达到对淀粉样蛋白的清除和吞噬效果，从而延缓神经细胞凋亡的过程〔8〕，并改善认知功能。其次，维生素D在神经元、神经胶质细胞等中的存在很广泛，它通过增加谷胱甘肽的含量来影响抗氧化机制、神经元内钙的平衡等作用于这些细胞来调节神经营养因子的产生，当神经营养因子合成减少时，人的学习记忆能力受累。维生素D能够提高神经营养因子的含量，降低神经细胞的毒性，对神经起保护作用。再次，维生素D既可以通过刺激神经形成和再生来调节神经营养因子的合成，也可以提高神经递质合成酶的活性。同时，维生素D是一种免疫抑制剂，可以通过抑制自身免疫反应来减少对神经系统的损伤。

Gezen-Ak等〔9〕对AD患者进行VDR基因多态性研究，结果提示Aa杂合子在病例组中较高，但病例组不符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则。Donald等〔10〕也对AD患者进行VDR基因多态性研究，发现ApaⅠ位点T等位基因增加AD的患病风险。可以得出VDR基因Apal位点中等位基因A可以早期阶段影响认知功能，即与MCI的患病有关。此次调查研究发现：VDR基因ApaI位点AA基因型为MCI的风险因素，A等位基因亦与MCI患病有关。这也初步证实了本实验结果与上述研究结论保持一致。

前期本研究课题组〔11〕对新疆南疆维吾尔族老年人进行的流行病学调查研究得到，VDR基因BsmI位点T基因型可能与MCI的患病有关，病例组及对照组间差异有统计学意义(P<0.05)。本次实验结果看出VDR基因BsmI位点CT基因型患病风险较CC基因型及TT基因型高，CC基因型认知功能较好，T等位基因是MCI的风险因素，与上述研究结果一致。

Uitterlinden等〔12〕在一项研究中提到VDR会在维生素D与VDR的结合过程中引起中间通路的改变，从而影响维生素D的作用。在此基因2号外显子上的FokI位点通过形成额外的三个氨基酸的细长结构，从而改变VDR的蛋白结果。VDR基因8号内含子的ApaI、BsmI位点内含子不同基因型在转录时有一系列连锁不平衡，与之基因表达的调控有关。如果交界处有突变发生，则正常的剪切方式也会随之发生变化，从而引起蛋白质结构的变化。故考虑通过影响基因表达的调控，调节基因转录的效率，影响认知功能。

本研究显示VDR基因ApaI、BsmI两个位点多态性与汉族老年MCI发病相关；血清25(OH)D水平的下降可能影响MCI的发生发展。血清25(OH)D水平与维生素D受体在MCI的发病过程中起着重要作用。但本研究主要针对汉族人群，且样本量较少，如能进一步扩大MCI人群，用更加科学的实验技术和方法以及更新颖的实验设计方案证明VDR基因多态性与血清25(OH)D水平在MCI中的作用可能更科学。