暖木条荚蒾果抗氧化成分的制备及主要活性成分分析

符 群，王梦丽，李 娜，吴 桐

（东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

荚蒾属ViburnumLinn.为忍冬科Caprifoliaceae的一类落叶灌木植物，温带、亚热带地区均有分布，天然资源颇为丰富[1]。荚蒾植物的活性成分主要为多酚类[2]、黄酮类[3]、多糖类、挥发油、萜类、生物碱类、甾体类等[4-6]；其根、茎、叶及成熟果实均可入药，有清热解毒、祛风除湿、健脾消食、镇咳祛痰、通经活络、抗衰老等功效[7-10]。暖木条荚蒾Viburnum burejaeticumRegel et Herd 又名修枝荚蒾，是荚蒾属分布较广的一类，产于中国大部分地区，朝鲜、日本、欧洲等地也有分布，资源极为丰富[11-13]，目前该植物多作为绿化植物，叶及嫩枝入药可治疗疮疥、皮肤瘙痒、风湿病、关节炎类疾病，果实无毒可食，但是口味不佳，相关深入开发研究报道很少，处于落果荒山的现状，造成天然资源极大的浪费。

天然活性物质的高效提取是对原料精深加工、获得高附加值产品的关键技术[14]。溶剂提取法往往存在提取时间长、溶剂用量大、提取效率低的问题。超声波具有特有的空化作用、机械效应及热效应，可增大介质的分子穿透力，增强对原料细胞壁破坏[15]，配合溶剂提取可使提取物有效溶出，提高得率，缩短时间和能耗，弥补溶剂提取的缺点，且设备形式可根据需要灵活设计为罐体式、隧道式、极板式等，操作简单、无污染，产业化程度高[16-18]。

人的疾病和衰老主要来源于体内自由基的氧化作用。在人体正常代谢中，自由基处于生成和消除的动态平衡，若自由基生成过多或清除过少，蓄积的自由基则会损害机体，增加高血压、糖尿病、肿瘤等疾病的发病率。相对于药物合成类抗氧化剂，天然食源性植物类抗氧化剂具有无毒副作用、来源广泛、且可直接作用于自由基或通过破坏自由基链的反应，从而有效地抑制或缓解疾病的发病率等优点更受到社会的认可及研究者的关注[19-20]。

本研究采用超声波辅助乙醇溶剂法对暖木条荚蒾果抗氧化成分进行提取，以DPPH·清除率为指标优化工艺条件，以获得最大的利用价值；并初步测定果实中主要成分及其与抗氧化指标的相关性，为进一步开发利用奠定基础。本实验旨在填补暖木条荚蒾高值化研发领域的空白，为荚蒾属植物的高效利用提供科学依据与理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

暖木条荚蒾鲜果：黑龙江省萝北林业局林场提供。

芦丁（≥98%），Solarbia；抗坏血酸（≥98%），Sigma；1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)，Sigma；没食子酸，上海鼓臣生物科技有限公司；牛血清蛋白，生工生物工程（上海）股份有限公司；2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），Sigma；其它化学试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

T6 新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SB25-12DTD 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；酶标分析 仪（EPOCH12）：BioTek Instruments，Inc.；XSE204 电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器中国有限公司）。

1.2.1 原料预处理

原料去杂，45 ℃烘干，破碎为60 目粉末，冷藏保存。

1.2.2 单因素试验

准确称取2 g 原料粉，用70%乙醇溶液进行提取。在前期预实验基础上，选取提取工艺中的显著影响因素：料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL，提取时间30、40、50、60、70 min，提取温度30、40、50、60、70 ℃，超声功率270 W，进行提取。研究3 组因素对DPPH·清除率、固形物提取率的影响，每组实验做3 组平行。

1.2.3 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，采用中心组合Box-Benhnken Design 设计试验，以DPPH·清除率为响应值，建立回归模型，得到最佳提取条件。

1.2.4 DPPH·清除率的测定

配制浓度为2×10-4mol/L 的DPPH·乙醇溶液，取提取液2 mL 于10 mL 具塞试管中，加入2 mL DPPH·乙醇溶液，混匀，室温避光放置30 min，75%乙醇调零，在波长517 nm 下测吸光值（Ai）；同时取2 mL95%的乙醇代替DPPH·乙醇溶液，测定吸光值（Aj）；再取2 mL DPPH·乙醇溶液代替提取液，测定吸光值（A0）；每组试验做3 组平行，按照公式（1）计算清除率[21-22]。

1.2.5 ·ABTS+清除率的测定

取等体积7 mmol/L 的ABTS 溶液和2.45 mmol/L 的过硫酸钾溶液配制混合液，于23 ℃下避光反应12～16 h，制备ABTS+溶液。用蒸馏水稀释基液（40～50 倍）使其在波长734 nm 处吸光度（A0）为0.700±0.005，制得ABTS+工作液。取 0.1 mL 供试液于10 mL 具塞试管中，与3.9 mL上述工作液混合，23 ℃下避光反应6 min，以蒸馏水作为空白对照，于734 nm 波长下测其吸光度值（A）；每组试验做3 组平行，按照公式（2）计算清除率[23-24]。

1.2.6 羟基自由基清除率的测定

取10 mL 比色管，加入1 mL 0.15 mg/mL 的1,10- 邻二氮菲溶液，3.8 mL pH 值7 的PBS 缓冲溶液，1.5 mL 0.2 mg/mL 的FeS04溶液，再加入供试液，混匀，最后加入蒸馏水定容至刻度，于37 ℃水浴恒温1 h，在波长536 nm 处测定吸光度（A0）；受损伤管中加入1 mL 浓度为0.01%的NaOH 溶液代替供试液，测定吸光值（A2）。未受损伤管加入蒸馏水代替供试液，测定吸光值（A1）；每组试验做3 组平行，按照公式（3）计算清除率[25-26]。

1.2.7 固形物提取率的测定

将提取滤液放入恒温干燥箱中，挥干溶剂，得干燥固形物质量（m1），原料质量为m2，按公式（4）计算提取率，每组试验做3 组平行。

1.2.8 主要活性成分的测定

1）总黄酮的测定

参考文献[15]，以不同浓度的芦丁标准液，制作标准曲线。

式（5）中：C为样液黄酮质量浓度（mg/mL）；V为样液体积（mL）；M为样品质量（g）

总黄酮标准曲线：y=2.706 2x+0.002，R2=0.999 5。

2）可溶性多糖的测定

参考文献[27]，制作测定葡萄糖的标准曲线。

式（6）中：C为测得的样品溶液的葡萄糖质量浓度（mg/mL）；V为样液体积（mL），本实验取 100 mL；m为供试品质量（mg）；

可溶性多糖标准曲线：y=13.643x+0.063 3，R2=0.990 1。

3）总多酚的测定

参考文献[22]，以不同浓度的没食子酸标准液，制作标准曲线。

式（7）中：C为没食子酸浓度（mg/mL）；V为样液体积（mL）；N为稀释倍数；M为样品质量（g）。

总多酚标准曲线：y=9.83x+0.009 7，R2=0.999 4。

4）可溶性蛋白的测定

参考文献[28]，以不同浓度的牛血清白蛋白标准液，绘制标准曲线。

式（8）中：C为测得的样品溶液的可溶性蛋白浓度 （μg/mL）；M为供试品质量（mg）。

可溶性蛋白质标准曲线：y=1.535 3x-0.010 5，R2=0.991 2。

1.3 数据处理

采用Excel 2016、Origin 8.6、Design-Expert 8.0.6进行绘图及数据分析、SPSS 20.0 软件对数据处理。

2 结果与分析

2.1 提取率及DPPH·清除率的单因素试验结果

2.1.1 料液比的影响

在提取时间50 min、提取温度50 ℃、超声功率270 W 条件下，用70 %乙醇进行提取，研究不同水平的料液比对DPPH·清除率、固形物提取率的影响，每组实验做3 组平行，结果如图1所示。

由图1可得，随着提取溶剂比例的增大，清除率逐渐增大，当料液比为1∶20 时荚蒾果提取物有最大DPPH·清除率（92.21±0.86）%；在1∶15时固形物提取率最高为（55.03±0.79）%，而此时清除率偏低，说明此时提取的物质不完全具有抗氧化活性，同时溶剂的大量使用带来成本的大幅提高，因此选取料液比1∶20 为最佳条件。

2.1.2 提取时间的影响

在料液比（1∶20）g/mL、提取温度50 ℃、超声功率270 W 条件下，用70 %乙醇进行提取，研究不同提取时间对DPPH·清除率、固形物提取率的影响，每组实验做3 组平行结果如图2所示。

图1 料液比对DPPH·清除率、固形物提取率的影响Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on DPPH radical scavenging capacity and solid matter extraction rate

图2 提取时间对DPPH·清除率、固形物提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on DPPH radical scavenging capacity and solid matter extraction rate

由图2可知，随时间的增加超声波的机械效应、气蚀作用、空化作用增强，原料活性物质逐渐被溶出，荚蒾果提取物对DPPH·清除率持续上升，当时间50 min 时达到最大值（94.65±0.914 02)%；时间进一步增加易造成物料升温使提取物失活，导致清除率下降。固形物提取率随时间增加逐步降低，时间为50 min 时最低为（55.18±0.67）%，抗氧化活性却逐步增强，说明提取物中的抗氧化有效成分充分溶出。可见超声时间越长，活性物质提取越充分；但时间过长又对活性物质起到破坏作用，且提取时间过长在生产实践时造成能源浪费，选择提取时间50 min 为最优值。

2.1.3 提取温度的影响

在料液比（1∶20）g/mL、提取时间50 min、超声功率270 W 条件下，用70 %乙醇进行提取，研究不同的温度对DPPH·清除率、固形物提取率的影响，每组实验做3 组平行，结果如图3所示。

图3 提取温度对DPPH·清除率、固形物提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on DPPH radical scavenging capacity and solid matter extraction rate

由图3可得，随温度的提高，分子间的运动加速，活性物质更易溶出，荚蒾果提取物对DPPH·清除率逐步增大，在60 ℃时达到最大值，（95.59±0.98）%，在70 ℃时清除率显著下降，可见过高的温度影响提取物活性，导致竞争性杂质溶出，降低荚蒾果提取物对DPPH·清除率。随温度的提高，固形物提取率也逐步提高，可得提取物中活性成分比例相应增加，抗氧化能力提高。因此选取60 ℃为最佳提取温度。

2.2 响应面优化结果

1）根据单因素试验结果，以DPPH·清除率为响应值，利用Design-Expert 软件设计试验水平，进行测定。

对测定结果进行二次多项式回归拟合，得DPPH·清除率（Y）对料液比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）的回归方程为：

Y=96.60+0.28A-0.15B-0.70C+0.34AB-0.52AC+ 0.57BC-1.46A2-1.05B2-1.18C2。

2）方差分析，结果如表1所示。

由表1可得，模型的F值为22.29，P＜0.01，说明该模型极显著，失拟项P＞0.05，不显著。R2=0.996 3，校正决定系数(R2Adj)=0.922 9，说明拟合度好，多项式回归方程对于实际情况来说较吻合，试验误差小，方程的显著性、可靠性高，可以反应响应值的变化。故可用回归方程对试验结果进行分析和预测。

对回归模型显著性分析可得：提取温度（C）对DPPH·清除率有极显著影响（P＜0.01），AC、BC、A2、B2、C2对DPPH·清除率均有显著影响（P＜0.05），A、B、AB 影响不显著（P＞0.05）。由F值可得，各因素对DPPH·清除率的影响顺序为：提取温度（C）＞料液比（A）＞提取时间（B）。

表1 回归模型方程系数及方差分析†Table1 Regression coefficients of equation and variance analysis

3）响应面图和等高线图分析

分析图4～6 可得出料液比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）之间的交互作用对DPPH·清除率的影响。由图4可知，料液比和时间的变化曲面均相对平缓，可得料液比、时间对DPPH·清除率均不显著。由图6可知，温度的响应曲面比时间的响应曲面陡峭，说明温度对DPPH·清除率较时间更为显著，与方差分析相符。当等高线呈密集的椭圆形和马鞍形时，说明两因素交互作用显著；呈现圆形时说明因素间交互作用不显著[15]。由图5、图6可知，等高线偏椭圆形，说明料液比和温度、时间和温度对DPPH·清除率的交互作用显著。由图4可知，等高线呈现圆形，说明料液比和提取时间之间的交互作用不显著，与方差的分析结果相符。

4）最佳条件的确定和试验结果的验证

图4 料液比和提取时间对DPPH·清除率交互影响的响应面图和等高线Fig.4 Response surface diagram and contour plots of interaction effects of solid-liquid ratio and extraction time on DPPH radical scavenging rate

图5 料液比和提取温度对DPPH·清除率交互影响的响应面图和等高线Fig.5 Response surface diagram and contour plots of interaction effects of solid-liquid ratio and extraction temperature on DPPH radical scavenging rate

图6 提取时间和提取温度对DPPH 清除率交互影响的响应面图和等高线Fig.6 Response surface diagram and contour plots of interaction effects of extraction time and extraction temperature on DPPH radical scavenging rate

通过响应面分析得到DPPH·清除率的最佳工艺条件为：料液比1∶21.6，提取时间39.2 min，提取温度55.1 ℃；同时乙醇浓度70%，超声功率为270 W，在此条件下DPPH·清除率的预测值为96.750 5%。为实际操作中更便于产业化控制，调整最佳工艺为：料液比1∶20，提取时间39 min，提取温度55 ℃，乙醇浓度70%，超声功率270 W。在此条件下进行最优工艺的验证，得到实际情况下的DPPH·清除率为（97.32±1.73）%，并测得此时固形物提取率为（56.28±0.96）%。

按照同样方式，采用单一的溶剂法进行提取（料液比1∶20，提取时间39 min，提取温度55 ℃，乙醇浓度70%），测得提取率为（43.78±0.72）%，DPPH·清除率为（90.07±1.67）%，说明超声辅助提取可大幅度提高提取效率，并显著增强DPPH·清除率，可以有效提升抗氧化活性成分的溶出。

2.3 暖木条荚蒾果提取物抗氧化性分析

按照超声辅助的优化条件，进行荚蒾果抗氧化成分的提取，测定不同浓度的荚蒾提取物对·ABTS+清除率、OH·清除率、DPPH·清除率的能力，并与同浓度的VC进行抗氧化性比较，计算IC50值，分析荚蒾果抗氧化能力。

2.3.1 ·ABTS+清除率

以同质量浓度的VC为阳性对照考察荚蒾果提取物的·ABTS+清除能力，结果如图7所示：

由图7可得，在质量浓度0～2.5 mg/mL 之间VC和荚蒾果提取物对·ABTS+清除力均呈现逐渐上升的线性关系，随质量浓度继续上升，·ABTS+清除能力上升缓慢，当质量浓度为5mg/mL 时，VC清除·ABTS+的能力达到（99.73±1.649）%、荚蒾果提取物为（90.71±1.72）%。经分析可得出VC清除·ABTS+的IC50=0.503 mg/mL，荚蒾果的醇提物清除·ABTS+的IC50=1.352 mg/mL。抗氧化剂提供电子或氢原子可清除自由基，导致ABTS溶液颜色发生变化，导致吸光值的变化，进而测其清除自由基的能力。荚蒾果提取物具有一定的·ABTS+清除力，可作为良好抗氧化原料的来源。

图7 荚蒾果提取物对·ABTS+的清除能力Fig.7 Scavenging capacity of the fruits of Viburnum extraction on ABTS radicals

2.3.2 羟自由基清除率

由图8可得，在质量浓度为0.01～ 0.05 mg/mL 的范围内，表现出良好的剂量依赖关系。随着浓度不断增加，VC和荚蒾果提取物对OH·的清除能力均明显上升，趋势相似，但VC变化程度偏大。质量浓度为0.05 mg/mL 时清除率分别为（85.68±1.09）%、（58.63±1.69）%。分析得出VC清除OH·的IC50=0.039 mg/mL，荚蒾果提取物清除OH·的IC50=0.045 mg/mL，两种物质的IC50差异不显著（P＜0.05），可以说明荚蒾果提取物对OH·具有较强的清除能力，且与VC无显著性差异。荚蒾果提取物清除OH·可能是因为其活性氢与-OH自由基结合生成水，中断了中间有色产物的积累。

2.3.3 DPPH·清除率

由图9可得，在质量浓度为2～10 μg/mL 的范围内，VC对DPPH·清除力逐步上升，10 μg/mL 时为（98.72±1.62）%；分析得出VC清除DPPH·的IC50=3.406 μg/mL。在相同的质量浓度范围内，随着提取物质量浓度的增加，对DPPH·清除力先缓慢上升，大于8 μg/mL 时，清除能力大幅度上升，10 μg/mL 时为（68.28±1.12）%。分析得出荚蒾果的提取物清除DPPH·的IC50=7.859 μg/mL。荚蒾果能清除DPPH·可能是因为提取物释放氢离子，可配对孤对电子，使DPPH·生成稳定的化合物。

图8 荚蒾果提取物对OH·的清除能力Fig.8 Scavenging capacity of the fruits of Viburnum extraction on OH radicals

图9 荚蒾果提取物对DPPH·的清除能力Fig.9 Scavenging capacity of the fruits of Viburnum extraction on DPPH radicals

2.4 提取物中主要活性成分含量以及与抗氧化相关性分析

分别按照线性回归方程及公式（5～8）计算荚蒾果中主要成分的含量，结果见表20

表2 荚蒾果提取物中主要活性成分的含量Table2 The content of main active components in the extraction of the fruits of Viburnum

由表可2 得：荚蒾果提取物中活性成分的含量：可溶性多糖＞总多酚＞总黄酮＞蛋白质。可溶性多糖和多酚的含量显著高于其它天然浆果资源，从而使其具有相关活性功能，可作为植物抗氧化剂的原料来源。

荚蒾果的抗氧化能力与总黄酮、总多酚、可溶性多糖和可溶性蛋白之间的相关性见表3。

表3 荚蒾果主要成分与抗氧化活性的相关性†Table3 Correlation between antioxidant capacity and antioxidant content

由表3可得：主要成分与抗氧化活性的比较，总黄酮、可溶性多糖、总多酚含量与DPPH·清除能力、·OH 清除能力、·ABTS+的清除能力之间存在极显著相关性，综合比较3 种抗氧化指标，总多酚相关性最强可溶性多糖和总黄酮次之；可溶性蛋白与DPPH·清除率、·OH 清除能力无显著相关性，与DPPH 的清除能力显著相关。由此可得，与其他成分相比总多酚与3 种抗氧化指标的相关性最高，因此总多酚为暖木条荚蒾果实抗氧化活性的主要成分。

3 结论与讨论

DPPH·是一种比较稳定的非生理自由基，能够被具有抗氧能力的物质清除，清除率越大表明抗氧化能力越强，常用于定量衡量天然活性物质或食品的抗氧化能力。本研究采用超声辅助法以固形物提取率及DPPH·清除率为单因素考察指标，以DPPH·清除率为响应值，优化了暖木条荚蒾果中抗氧化活性物质最佳提取工艺条件，最终得固形物提取率为（56.28±0.96）%，DPPH·清除率为（97.32±1.73）%。较非超声法提取率高出12.5 % （P＜0.01），DPPH·清除率高出7.25%（P＜0.01），可实现高效提取，表明超声波辅助提取可有效保持荚蒾果提取物的抗氧化活性。可能是不同处理过程活性物质的结构发生不同的改变，超声辅助可使活性成分与活性作用有关的位点暴露出来，从而显著提高其抗氧化活性。

暖木条荚蒾果提取物对·ABTS+清除率、OH·清除率、DPPH·清除率的能力的IC50值分别为1.352、0.045、7.859 μg/mL，且对OH·清除率与VC相比无显著性差异。荚蒾果提取物中以可溶性多糖、总多酚的含量居多，与其他活性成分相比总多酚与3 种抗氧化指标相关性系数最大且极显著（P＜0.01），可得总多酚为荚蒾果抗氧化成分的主要来源。相关文献研究也表明，多酚类化合物具有较强的抗氧化性[29]，可以通过抑制自由基产生、直接清除自由基、激活机体抗氧化的体系等方式进行体内的抗氧化作用，且抗氧化性可能是其发挥功效的药理基础。

综上所述，超声波的3 大效应协同乙醇溶剂，能较好地提高提取效率，降低生产成本，且良好保留暖木条荚蒾果实的抗氧化活性，丰富了暖木条荚蒾植物活性功能研究领域的空白。当然，仅研究了超声辅助醇法这一种提取方式，其他的提取方式是否能更高效地提高其抗氧化活性有待于进一步研究。如：唐仕荣等[30]采用溶剂回流、超声波、微波、超声波微波协同萃取和亚临界水萃取5 种方法提取余甘子多酚，发现亚临界水萃取的多酚提取率和抗氧化能力明显高于其他方法，此方式可通过调节亚临界水的状态实现选择性萃取，避免了有机溶剂残留，被视为绿色环保的高效提取技术；何力等[31]采用DPPH·自由基清除率研究微波辅助提取黄岑多酚提取的抗氧化能力，结果表明多酚得率明显优于传统回流提取，因为微波能通过偶极子旋转和离子传导两种方式同时加热，加剧分子的碰撞频率，使多酚分子更易从药材内部扩散到萃取溶剂中且大大缩短了加热时间，尤其适合极性分子的萃取；徐彩红等[32]采用超声辅助酶法提取玉米皮总多酚，通过生物技术酶解破壁来改善提取效果，避免了提取溶剂的污染，测得其具有较强的抗氧化活性。关于活性物质提取方式还有：减压-超声法、半仿生法、盐析法等，这些方法均可适当的运用到暖木条荚蒾果实活性物质的提取，以期筛选简便且高效的方式。此外关于暖木条荚蒾果多酚的结构、其他单体的组成成分以及其体内抗氧化活性机制与多酚的构效关系是也今后研究的重点。