8种市售“金花”茶中微生物的分离鉴定①

杨瑞娟 王桥美 彭文书 季爱兵 张文杰 严 亮

(1云南农业大学食品科学技术学院 云南昆明650201;2普洱茶研究院 云南普洱665000;3云南农业大学植物保护学院 云南昆明650201;4滇西应用技术大学普洱茶学院 云南普洱665000)

茯砖茶早期称“湖茶”，功效类似于土茯苓，所以又称“茯茶”，比较有名的有安化黑茶、泾阳茯砖等，是古老茶类黑茶中的高档茶。微生物在茯砖茶的形成中，有不可替代的作用［1］。普洱茶产于云南，是以地理标志保护范围内的云南大叶种茶为原料，经杀青、揉捻、晒干制成晒青毛茶，再经人工洒水，渥堆微生物发酵之后而成的后发酵茶类，微生物代谢产生的多种生化产物，形成了普洱茶多样化的风味［2］。白茶也是我国六大茶类之一，福鼎是中国的白茶之乡，是白茶的主要产区和出口基地［3］，为满足广大消费者的需求，白茶的加工工艺也在创新和发展。

“金花”民间称“金花菌”，能分泌多种胞外酶催化茶叶化合物的转化，改善茶叶品质［4］。在茶叶上人工接种冠突散囊菌能够显著地提高茶叶的抗氧化活性，增强防止脉粥样硬化能力，冠突散囊菌发酵产生的次级代谢产物也显示出较好的抗菌及抗肿瘤作用［5］。以冠突散囊菌为代表的“金花菌”对于黑茶砖茶色泽、风味、品质具有重要的影响［6］。

传统的茯砖茶有发花工艺，常常以“金花”含量的多少来衡量其品质的好坏，但是传统的普洱茶和紧压白茶并无发花工艺。随着茶保健功效的突出，越来越受广大消费者的欢迎，各种茶都出现了一些创新工艺，比如市面上销售的增加了发花工艺的“金花”老白茶、“金花”普洱茶等。为避免劣质茶叶充斥市场，避免消费者误将发霉的砖茶当作“金花”茶，笔者基于传统培养的方法及DNA测序鉴定技术，对市售的含有“金花”的8种茶样（陕西及湖南的茯砖茶、福建老白茶、普洱生茶、普洱熟茶）的微生物进行了分离鉴定，旨在揭示各种“金花”茶内含微生物的种类及各种茶微生物之间的区别与联系，为“金花”茶生产工艺的优化及创新提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茶样

T1：泾阳茯砖（产自陕西，长方砖形，砖面紧实，色泽黑褐，砖内金黄色颗粒，干嗅有黄花清香）；T2：牛金花茯砖（产自陕西，长方砖形，砖面砖内都有金黄色颗粒）；T3：泾渭茯茶（产自陕西，长方砖形，茶梗明显，砖面略松散，色泽黑褐，砖内少量金黄色颗粒）；T4：安化黑茶（产自湖南，长方砖形，砖面略松散，黄片明显，色泽黑褐，砖内少量金黄色颗粒，有淡淡的菌花香）；T5：安化黑茶黄片（产自湖南，长方砖形，压制较松散，色泽黄褐，略见金黄色颗粒）；T6：福鼎金花老白茶（产自福建，长方小砖，压制略松散，色泽黄褐，略见金黄色颗粒）；T7：普洱熟茶（产自云南，长方砖形，压制紧实，色泽褐红，略见金黄色颗粒，陈香）；T8：普洱生茶（产自云南，长方砖形，压制紧实，色泽黄绿，砖内少量金黄色颗粒，兰花香）。茶样见图1。

图1 T1～T8茶样

1.1.2 培养基

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂18 g/L。

YEPD培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂18 g/L。

PDA培养基：马铃薯300 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15～20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌种的分离

“金花”的分离：在无菌条件下，用无菌接种针挑取茶叶上黄色闭囊壳或直接挑取带有黄色闭囊壳的茶叶碎片接入PDA培养基中，28℃培养72 h，进一步纯化后置于28℃培养。

在无菌条件下，采用LB和YEPD培养基，同一茶饼采用多点取样，混匀，进行其他可培养微生物的分离［7］。

1.2.2 菌种的鉴定

对菌种的DNA进行扩增［8］，将PCR扩增产物送至广州华大基因测序，根据测序结果，在GenBank数据库中挑选与靶系列相似度为100%的参考菌株系列，完成菌种鉴定。

2 结果与分析

2.1 茶样中“金花”培养图片及分子鉴定结果

经过多次重复实验，对8个茶样中的“金花”菌进行分子鉴定，从茶样T1、T3和T5中分离得到冠突曲霉Aspergillus cristatus（KM388844.1、KF923733.1、LT670939.1），从茶样T2、T4和T8中分离得到冠突曲霉Aspergillus cristatus（LT670938.1、LT670946.1、KJ018706.1） 和冠突散囊菌Eurotiumcristatum（KR812327.1、KC865304.1、JQ743649.1），从茶样T6和T7中分离得到冠突散囊菌Eurotium cristatum（KR812327.1和KT151565.1），见图2。冠突散囊菌是冠突曲霉的有性型，属于散囊菌目发菌科散囊菌属的一种真菌，属于“益生菌”，可生长在土壤、茯砖茶、冬虫夏草、中药片、沉香、木屑等基物上。

图2 T1～T8“金花”培养图

2.2 可培养微生物鉴定结果

由表1可知，T1、T2、T3中分别含有微生物15、7和8种，仅TI茶样中有微生物Aspergillus appendiculatus，T1、T2、T3 3个茶样都有微生物Aspergillus intermedius和Eurotium amstelodami，T2和T3茶样中有微生物Aspergillus ruber。T4和T5分别含有微生物7种和12种，T4和T5两茶样中都有微生物Aspergillussp.6 VH-2016，仅T5茶样中有微生物Aspergillus gracilis，曲霉属是普洱茶发酵中的优势菌，在茯砖茶的发酵中也常被分离鉴定出来。T6所含微生物有16种。T7所含微生物有18种，假黄曲霉Aspergillus pseudoelegans、针刺曲霉Aspergillus spiculosus、桔青霉Penicillium citrinum和灰黄青霉Penicillium griseofulvum是T7茶样中独有的。T8所含微生物有18种，Absidia corymbifera、Aspergillusostianus、Lichtheimiacorymbifera和Lichtheimia ornata是T8茶样中独有的，Absidia corymbifera在酒曲中及蔗糖的发酵中也较常见，有很好的工业应用价值。

表1 茶样中其他可培养微生物

续表1 茶样中其他可培养微生物

续表1 茶样中其他可培养微生物

续表1 茶样中其他可培养微生物

2.3“金花”茶样所含微生物比较

由图3可知，同是“金花”茶，茶样中表现出了一些共有微生物，如8个茶样中都分离鉴定出了阿姆斯特丹曲霉和谢瓦氏曲霉，但是由于不一样的加工工艺，茯砖茶、白茶、普洱茶中的微生物又各有不同。具体如下：（1）同一产地同一类茶中有一些共有的微生物，如，阿姆斯特丹散囊菌是T1、T2、T3 3个茯砖茶样中共有的，且此菌在茯砖茶里比较常见；Aspergillus ruber是T2和T3两个茯砖茶样中共有的；Aspergillus melleus、Aspergillusochraceus、Aspergillus sclerotiorum、Aspergillus westerdijkiae及Eurotium herbariorum是T7和T8两个普洱茶样中共有的。（2）不同产地的同一类茶亦有共同的微生物，如，阿姆斯特丹曲霉、谢瓦氏曲霉和赤散囊菌Eurotium rubrum是T2、T3、T4茶样中共有的，T2、T3产地是陕西，T4产地是安化，但都属于黑茶中的茯砖茶。（3）不同产地不同类别的茶样中会含有同种微生物，如，Aspergillus montevidensis和Eurotium rubrum是T1～T6茶样中共有的；高渗散囊菌Eurotium tonophilum是T6和T8茶样中共有的；蜡叶散囊菌Eurotium herbariorum是T1、T7和T8茶样中共有的；假灰绿曲霉Aspergillus pseudoglaucus是T1和T7中共有的。（4）有些微生物是某些茶样中独有的，如，Aspergillus gracilis是T5茶样中独有的，桔青霉和灰黄青霉是T7茶样中独有的，Lichtheimia corymbifera是T8茶样中独有的。

3 讨论

冠突散囊菌和冠突曲霉目前市面上都被称为“金花”，除了DNA序列分析，还要通过菌株的表观形态、光学显微镜、扫描电镜等方法［9］才能具体确认两者的区别，冠突曲霉通过有性发育可以产生冠突散囊菌［10］，茯砖茶中比较常见，“金花”越多，茶叶品质上表现为口感更加甜滑甘爽，且汤色更红艳明亮，对消化系统及睡眠的改善效果显著［11］，关于茯砖茶中的“金花”及其他微生物的研究已经很多，但是最近市面上出现了“金花”白茶、“金花”普洱等新产品，对于新茶产品中的“金花”是否与茯砖茶中的一致，抑或其他有害微生物，人们的质疑比较多，相关的研究也很少，笔者以市面上能买到的几种“金花”茶为样品，对“金花”菌进行了培养和测序鉴定，发现白茶和普洱茶种的“金花”不是有害微生物，而是冠突散囊菌或者冠突曲霉，所以“金花”白茶、“金花”普洱可以放心饮用。

除了对8种茶样品中的“金花”进行了鉴定，笔者还分离出了一些功能微生物，如，阿姆斯特丹散囊菌可以用于去除污水中反流产物的染色问题［12-13］；Aspergillus ruber可以生产单宁酶，且产量较高［14］。蜂蜜曲霉Aspergillus melleus可以制备AMP脱氨酶、Aspergillus sclerotiorum的次级代谢产物可以抗肿瘤［15］，Eurotium tonophilum中含抗利什曼病的化合物［16］，Eurotium herbariorum对K562肿瘤细胞系具有细胞毒性［17］，假灰绿曲霉与冠突曲霉功能类似，能够在黑茶内产生金花［18］，Aspergillus gracilis能分泌废水生物修复中的酶，桔青霉可以降解聚乙烯材料［19］，也有一些随着条件变化可以产生有害物质的微生物，如Aspergillus ochraceus、Aspergillus westerdijkiae等，条件控制不当可以产生赭曲霉毒素［20-21］等，这些微生物的分离对茶功能研究提供了理论基础。

图3 茶样所含微生物的网络图

近年，普洱茶相关微生物的研究也很多，但“金花”普洱属于新兴产品，相关研究还很少。白飞荣等［22］研究表明，普洱茶发酵中可培养的优势真菌为Aspergillus luchuensis、Aspergillusneoniger、Aspergillusfumigatus、Penicilliumsp.、Cladosporium sp.等，但是本文中的“金花”普洱却发现了大量的Aspergillus amstelodami、Aspergillus pseudoelegans、Aspergillusspiculosus、Eurotium herbariorum等真菌，说明普洱茶中增加发花工艺，可能影响普洱茶中可培养真菌的种类和数量。白茶属于轻微发酵茶，微生物对茶叶品质的影响很小，常规白茶微生物的研究很少，且更不可能含有“金花”，但是笔者从福鼎老白茶中分离出来的微生物种类很多，且跟茯砖茶的微生物种类很相似，有可能是发花工艺所影响。陈勇强［3］也从市售“金花”福鼎紧压白茶中分离得到“金花”典型菌株，马燕等［23］亦从“金花”普洱茶中分离鉴定出Lichtheimia corymbifera，这些均与本研究结论一致。

“金花”普洱茶、“金花”老白茶属于创新工艺生产的茶，与传统的的普洱茶和白茶口感及微生物的种类都有所差别，相关研究也很少。白茶、普洱茶等传统名茶增加发花工艺从而也自带“金花”，会不会影响茶叶的品质、内含物质及口感，会不会对人体产生别的影响还有待进一步验证。鉴于安全性考虑，“金花”茶中优势菌种的功能、酶学特征及安全性评价也是下一步的研究重点。