增龄对大鼠心肌缺血再灌注后TLR-4的影响

林运灵

[摘要] 目的 探讨增龄对大鼠心肌缺血再灌注后TLR-4及相关炎症因子的影响。方法 选取该院于2018年1—6月间实验室以青年（3月龄）及老年（18月龄）清洁级健康雄性SD大鼠建立心肌缺血再灌注模型，依据鼠龄分为：①假手术青年组（Sham-Y组）及假手术老年组（Sham-A）;②心肌缺血再灌注青年组（IR-Y组）及心肌缺血再灌注老年组（IR-A组）。检测大鼠心肌梗死面积、炎症因子变化，蛋白电泳分析TLR-4表达的变化。结果 与Sham-Y组相比， Sham-A组TNF-α（30.1±5.3）ng/mL、IL-6水平（34.2±3.7）pg/mL顯著增高（P<0.05）;缺血再灌注后，与IR-Y组相比，IR-A组心肌梗死面积显著增大;与IR-Y组相比，IR-A组血清TNF-α（421.2±56.9）ng/mL、IL-6水平（129.3±11.5）pg/mL显著增高（P<0.05），血清IL-10水平（48.2±4.1）pg/mL显著减低（P<0.05）;与IR-Y组相比，IR-A组TLR-4表达显著增强，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 增龄导致心肌缺血再灌注后心肌TLR-4及其相关炎症因子表达增强。

[关键词] 心肌缺血再灌注损伤;Toll样受体;炎症

[中图分类号] R54          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2019）09（c）-0008-03

[Abstract] Objective To observe the effects of aging on TLR-4 and related inflammatory factors after myocardial ischemia-reperfusion in rats. Methods The model was established in the laboratory from January to June 2018. The model of myocardial ischemia-reperfusion was established in young （3 months old） and old （18 months old） clean-grade healthy male SD rats， 1.sham-operated group （Sham-Y group） and sham-operated group （Sham-A）; 2.myocardial ischemia-reperfusion group （IR-Y group） and myocardial ischemia-reperfusion group （IR-A group）. The myocardial infarct size and inflammatory factors were detected in rats， and the expression of TLR-4 was analyzed by protein electrophoresis. Results Compared with Sham-Y group， TNF-α （30.1±5.3）ng/mL and IL-6 level（34.2±3.7）pg/mL were significantly increased in Sham-A group （P<0.05）. After ischemia-reperfusion， compared with the IR-Y group， the area of myocardial infarction in the IR-A group was significantly increased; compared with the IR-Y group， the serum TNF-α（421.2±56.9） ng/mL and IL-6 levels in the IR-A group （129.3±11.5）pg/mL was significantly increased （P<0.05）， serum IL-10 level （48.2±4.1） pg/mL was significantly decreased （P<0.05）; IR-A group TLR-4 expression was significantly enhanced compared with IR-Y group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Age-induced myocardial TLR-4 and its related inflammatory factors are enhanced after myocardial ischemia and reperfusion.

[Key words] Myocardial ischemia-reperfusion injury; Toll-like receptor; Inflammation

心血管病仍然是人口首位死亡原因[1]，受老龄化的影响，心血管病患病及死亡的绝对人数仍在持续上升[2]，给社会及家庭带来沉重的负担。与青年人相比，老年人心血管病预后更差。动物实验结果显示，与青年小鼠相比，老龄小鼠在心肌梗死后梗死区域扩展更为严重，心功能更差[3];诸多有效的干预措施如缺血后处理等在老年动物心脏也丧失其保护作用[4]。老年心脏对损伤的易感性的机制仍未得到阐明。

心梗后炎症反应为心脏修复所必需，TLR（Toll-like receptor，TLR）介导的内源性免疫反应是心肌缺血再灌注后炎症反应的重要组成部分。动物试验结果显示，抑制Toll样受体-4（TLR-4）的表达能够显著减轻梗死心肌炎症反应，减轻心肌损伤[5]。目前尚不清楚，衰老对心肌缺血再灌注后TLR-4及其相关炎症通路信号分子表达是否有影响。

该研究选取2018年1—6月间该院实验室参与实验的小鼠为研究对象，旨在通过对3月龄及18月龄大鼠建立心肌缺血再灌注模型，观察衰老对心脏TLR-4及其下游炎症信号分子的变化，探讨TLR-4在衰老大鼠心肌缺血后的作用及其可能机制，现报道如下。

1  材料

1.1  实验动物及分组

2月龄清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠（180～200 g），自由饮食，动物饲养及动物实验方案遵循国家《实验动物管理条例》。待各组实验动物分别饲养至3月龄、18月龄，分别进入假手术及心肌缺血再灌注组。该研究分组：①假手术组（Sham组）：只穿线不结扎，根据实验动物月龄再分为青年组（Sham-Y组）及老年组（Sham-A组）;②心肌缺血再灌注组（IR组）：根据实验动物月龄再分为青年组（IR-Y组）及老年组（IR-A组），每组动物8只。研究步骤详见动物模型建立部分。

1.2  试剂、仪器

氯化三苯基四氮唑（TTC）：美国Amresco 公司;伊文氏蓝：Sigma公司;美国RD公司TNF-α、IL-6、IL-10  ELISA试剂盒分别购于USCN及R&D公司; TLR-4 多克隆抗体及MyD88多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）。其余试剂为市售分析纯产品。BL-420E生物机能实验系统：成都泰盟科技有限公司;小动物呼吸机（TKR-200C）：江苏特力麻醉呼吸设备公司; Mini Trans-Bloe电泳仪（Bio.Rad公司，美国），全自动凝胶图象分析仪（Syngene公司，美国）， Image.Pro Plus图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）。

2  动物模型建立及指标检测

2.1  大鼠心肌缺血再灌注模型制备

缺血再灌注组以穿线结扎法结扎左冠脉建立大鼠缺血-再灌注模型[6]。缺血30 min后，松开丝线恢复血流，缺血心肌颜色从暗红变为鲜红，心电图显示抬高的ST段下降1/2，说明再灌注成功，逐层关胸。在大鼠出现吞咽动作后，拔除气管导管，放入笼中，继续保温，苏醒后自由饮水进食。假手术对照组动物模型复制方法同上，但只穿线但不收紧线。

2.2  检测指标与检测方法

2.2.1  心梗面积测定  心肌缺血区和心肌梗死范围的测定按照既往方案进行，计算梗死区（ infarct size， IS）心肌与危险区（area at risk，AAR）心肌重量的比值IS/AAR，用以表示心肌梗死范围的大小。心肌缺血区范围用心肌缺血区重量占左心室重量百分比（AAR/LV）表示。心肌梗死范围用心肌梗死区重量占心肌缺血区重量百分比（IS/AAR）表示。

2.2.2  血清TNF-α、IL-6、IL-10含量检测  处死前取静脉血1 mL，放入含乙二胺四乙酸二钠（EDTA）的EP管中，混匀后1 400×g离心15 min，取血浆-20℃保存。待标本收集齐后，于4℃冰箱自然解冻，按ELISA试剂盒说明书检测血清TNF-α、IL-6、IL-10的浓度。

2.2.3  Westernblot检测心肌TLR-4、MyD88表达  于再灌注7 d处死动物，取保存的心肌组织加入适当液氮研磨后，加入细胞裂解液，充分作用后于100℃加热，12 000 g/min离心10 min，取上清液，测定蛋白浓度（根据样品浓度调整上样蛋白量为50 μg/孔），经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至硝酸纤维素滤膜上，脱脂奶粉封闭，加入1： 1000稀释的一抗，4℃过夜，用辣根过氧化物酶标记的二抗检测目标蛋白。ECL化学发光试剂显色，X线胶片压片，显影、定影，图像分析系统测定目的条带灰度值，以目的蛋白与GAPDH条带的吸光面积积分比值来评定其蛋白表达水平。

3  统计方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据统计学分析。计量资料以（x±s）表示，用t检验，计数资料以[n（%）]表示，用χ2检验。对各组数据进行方差齐性检验（Levene检验）及正态性检验（F检验）。符合正态分布组间比较采用One-Way ANOVA分析，组间两两比较，方差齐者采用SNK-q检验，方差不齐采用Game-Howell检验;但若数据属于非正态分布，则采用Kruskal-wallis H检验;P<0.05为差异有统计学意义。

4  结果

4.1  各组心肌缺血与心肌梗死面积比较

青年组及老年组心肌缺血面积之间[（45.0±3.2）% vs （47.8±4.2）%]差异无统计学意义（t=0.16，P>0.05）。在心肌缺血再灌注后，与青年组（IR-Y组）相比，老年组（IR-A组）心肌梗死面积显著增大（42.8±3.4）% vs （55.4±5.1）%，差异有统计学意义（t=16.368， P<0.05）。

4.2  各组血清TNF-α、IL-6、IL-10含量比较

与假手术组相比，心肌缺血再灌注后，心肌再灌注组血清炎症因子含量明显增高。与Sham-Y组相比，Sham-A组血清TNF-α及IL-6水平显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）。如表1所示，与IR-Y组相比，IR-A组血清TNF-α及IL-6水平显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）;IR-A组IL-10水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

4.3  各组心肌TLR-4、MyD88含量比較

如图1所示，与假手术组相比，心肌缺血再灌注组大鼠心肌TLR-4、MyD88表达显著增强，差异有统计学意义（P<0.05）;与Sham-Y组相比，Sham-A组心肌TLR-4、MyD88水平显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）与IR-Y组相比，IR-A组TLR-4、MyD88表达显著增强，差异有统计学意义（P<0.05）。