猪抗凝全血样品检测非洲猪瘟时凝胶产生原因及避免措施探讨

罗嘉轩，冯云云

（1.江门市动物疫病预防控制中心广东 江门 529051；2.华南农业大学兽医学院 广州 510642）

随着非洲猪瘟的防控工作进入常态化和长期化的阶段，检测非洲猪瘟的数量和频率也在上升[1]。在生猪调运、供港供澳、常规监测以及流行病学调查等工作中常常都会采集猪的抗凝全血样品，而根据中国动物卫生与流行病学中心和中国动物疫病预防控制中心于2018 年8 月联合编制的《非洲猪瘟病毒检测操作规程（试行）》，检测样品应在60℃水浴30min 进行病毒灭活。

在灭活过程中样品常出现凝胶，难以通过移液枪吸取，影响实验进行[2]。为了解凝胶产生原因，更好地为实验开展提供参考，笔者对380 份猪全血样品进行分析。

1 材料和方法

1.1 样品来源、抗凝剂及状态

样品共360 份，来源为广东省江门市及阳江市的供港猪场，其中280 份来自于江门市，80 份来自于阳江市。样品均由相同的人员进行采集，采样人用注射器采集后保存于抗凝管中，抗凝剂为EDTA、肝素钠和枸橼酸钠。样品和冰袋一同放置于泡沫箱中进行送样，接样时样品状态正常，呈液体状，无凝胶、沉淀物产生。

1.2 样品检测方法

用一次性巴氏吸管吸取样品到1.5mL 离心管中，10,000r/min 离心3min，用一次性巴氏吸管把上清液转移到新1.5mL 离心管中，用干式恒温金属浴进行60℃30min 金属浴灭活病原，观察样品形态。

1.3 样品分组情况

样品分为三组。第一组样品于2019 年6 月3 日采集，共180份，来自9 个猪场，其中7 个来自于江门市，2 个来自于阳江市，样品采集后放置于-20℃保存，次日进行血清分离。第二组和第三组于2019 年6 月17 日采集，两组共180 份，来源场和第一组相同，其中有100 份于17 日当天进行血清分离，为第二组，另外80 份保存于4℃并于18 日进行血清分离，为第三组。

2 结果

离心前三组样品均为液态，其中第一组颜色与第二、第三组相比偏黑。离心后第一组呈液态、颜色均匀、无明显上清液产生，第二和第三组明显分层，上层为澄清液体，下层为沉淀物，其中第三组颜色较第二组偏红。

金属浴灭活后，第一组基本都呈现暗黑色凝胶状半固体，部分凝固程度较高的样品用移液枪吸取样品有困难，第二和第三组均呈液态，用移液枪吸取操作无障碍。

3 结果分析

第一组和第二、第三组耗材及样品采集方式、采集人员相同，可排除采样人员、耗材因素对结果影响。第一组和第三组的样品来自相同的场，样品的保存时间相同，保存温度不一致，结果第一组均产生凝胶，第三组均未产生凝胶，足以证明在零度以下环境保存是产生凝胶的关键原因之一。

第二组和第三组的保存温度相同，保存时间不一样，而两组均未产生凝胶，也可从侧面反映保存时间的差异与凝胶的产生相关性不大。而第一组凝胶主要在金属浴后产生，样品在金属浴之前均为液态，金属浴后均为凝胶态，形成自身前后对比，证明金属浴是产生凝胶的关键原因之一。

由于在实验中证明了在零度以下环境保存和金属浴两者为凝胶产生的必要因素，缺一不可。故推测有可能是样品保存于零度以下环境时，红细胞细胞膜由于结冰而破裂释放出血红蛋白，随后金属浴时加热使蛋白质发生变性，氢键等次级键被破坏，形成沉淀以及粘度增加，导致凝胶产生。

4 避免措施

由于缺乏猪全血非洲猪瘟阳性样品，尚不知凝胶的产生对检测结果是否有影响，但其粘稠度较大，影响实验操作，故在实际工作中应采取措施来避免凝胶的产生。主要的措施有注意采样送样的时效性以及采样后尽快进行血清分离，如果不能当天进行分离，应于2～8℃进行冷藏保存，避免在0℃以下环境保存。