烟草增香细菌的筛选及其作用效果

薛磊 郑泽浩 郭志刚 王颖 郭斌 陈炜 姜影影 来航线

摘  要：为研究烟草增香细菌对烟叶吸食品质的影响，以云南主要烟草种植区的根际土壤和新鲜烟叶为微生物分离源，对菌株产酶和降解功能进行筛选，并对烟丝发酵样感官质量和香味成分进行分析。结果表明，从供试云南微生物分离源样品中分离、筛选到一株可同时产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，并可降解β-胡萝卜素的复合功能型菌株YN14;与对照相比，菌株YN14发酵样的烟气细腻度有改善，香气质和香气量均有增加，甜感有增加，刺激减小;GC/MS分析结果也表明，YN14发酵样烟气中香味物质含量明显增加。菌株YN14经鉴定为芽孢杆菌属（Bacillussp.）细菌。综上所述，芽孢杆菌YN14具产多种酶和降解功能，并可明显改善烟草吸食品质。

关键词：烟草;烟丝发酵;增香微生物;芽孢杆菌;烟叶品质

中图分类号：S435.72          文章编号：1007-5119（2019）05-0060-08      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.05.009

Abstract： In order to study the effect of aroma-enhancing bacteria on smoking quality of tobacco， the rhizosphere soil and fresh tobacco leaves of the main tobacco-producing areas in Yunnan were used as the microbial sources. The multiple enzyme activities and degradation functions of the bacteria were screened， and the smoking quality and aroma components of the tobacco were analyzed after microbial fermentation. The results showed that： A complex functional strain YN14 which can simultaneously produce protease， amylase and cellulose， and degrade β-carotene was isolated and screened from the microbial sources in Yunnan. Compared with the control， the fineness and sweetness of the smoking of YN14 treated samples were improved， aroma quality and amount were increased; and the stimulation was decreased. The results of GC/MS analysis also showed that the content of aroma in smoke increased significantly in YN14 treated samples. The strain YN14 was identified asBacillussp.. In conclusion， theBacillusstrain YN14 has a variety of enzyme activities and degradation functions， and can significantly improve the smoking quality of tobacco.

Keywords：tobacco; fermentation; aroma-enhancing microorganism;Bacillus; quality of tobacco

煙叶发酵在烟叶生产过程中具有重要地位，在烟叶发酵过程中，烟叶会发生一系列复杂的物理、化学变化，使得烟叶中部分大分子化合物降解转化为具香味特性的化合物，从而影响烟叶吸味品质^[1]。

烟叶表面存在着大量的微生物，其在整个烟叶发酵过程中对烟叶品质改善发挥着巨大作用^[2]。因此，将微生物应用于烟叶人工发酵，不仅可缩短发酵周期，还可改善烟叶品质^[3]。近年来国内外关于利用微生物改善烟叶品质的研究也有报道。如利用烟碱降解微生物降低烟叶烟碱含量，改善劲头^[4-6]。或利用微生物来降低烟叶蛋白质含量，减少烟叶燃烧时由蛋白产生的焦味^[7]。也有研究通过微生物降解烟叶淀粉，提升烟叶总糖和还原糖含量，来提升烟叶品质^[8]。此外利用产纤维素酶菌株也可降低烟叶中纤维素含量以减少烟气的辛辣感和刺激性^[9-11]。但这些研究仅针对具有产单一酶或降解特性的微生物菌株，对于同时产多种酶的烟草增香微生物及其对烟叶品质改善作用的研究报道较少。

因此，本研究通过对云南典型烟草种植区域的微生物资源进行分离收集，并对其产多种酶能力、降解特性和烟丝发酵效果进行筛选，研究其对烟叶品质的影响，探讨将其应用于烟草发酵的可能，为烟草增香微生物资源的发掘及其工业应用提供技术指导与依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

样品来源：2017年采自云南省昆明、玉溪、曲靖、大理、保山、文山州、楚雄等地市典型烟草种植区的23份新鲜烟叶样品和23份根际土样。

供试烟丝：陕西中烟工业有限责任公司的低等级配方叶组烟丝，烟丝水分含量为12%。

1.2  试剂和培养基

试验试剂：Mix、Marker购自北京擎科新业生物技术有限公司，通用引物等购自生工生物工程（上海）股份有限公司;其他化学试剂均为国产分析纯。

分离培养基^[12]：细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用PDA培养基，放线菌采用高氏1号培养基。菌种液体培养采用LB液体培养基。

产酶筛选培养基：蛋白酶筛选培养基^[13]，淀粉酶筛选培养基^[14]，纤维素酶筛选培养基^[15]。

β-胡萝卜素液体培养基：K₂HPO₄1.0 g/L，MgSO₄0.5 g/L，NaNO₃3.0 g/L，FeSO₄0.01 g/L，KCl 0.5 g/L，蔗糖30.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，β-胡萝卜素2.0 g/L。

1.3  烟叶表面微生物分离

称取新鲜烟叶或土壤样品10.0 g，采用逐级稀

释法^[13]，挑取单菌落，纯化后备用。

1.4  烟用菌株的活性筛选

1.4.1  产酶和降解特性筛选试验  将分离到的菌株初步鉴定去重后，点接于产酶筛选培养基培养，以确定菌株产淀粉酶、纤维素酶或蛋白酶的功能，并测量菌株周围透明水解圈和菌落直径（淀粉酶平板需碘液染色，纤维素酶平板需刚果红溶液染色）^[13-15]，计算酶活比值：

酶活比值=（水解圈直径?菌落直径）/菌落直径

β-胡萝卜素降解试验^[16]：将菌株接种于β-胡萝卜素液体培养基，37 ℃、200 r/min下摇床振荡培养72 h，将菌液离心后，依据上清液吸光值与未接种对照的变化确定β-胡萝卜素降解能力。

1.4.2  菌株增香发酵与感官评吸  选取产酶和降解筛选试验表现较好的菌株，将单菌株接种于LB培养液中，37 ℃、160 r/min下摇床振荡培养24 h。菌液于4 ℃、8000 r/min离心10 min，将收集的单菌株菌体用无菌水配制成菌悬液，均匀喷洒在供试烟丝表面，以等量无菌水处理做对照，置于37 ℃、湿度80%的恒温恒湿箱中发酵培养48 h后，将烟丝烘干至水分为12%，备用。

將发酵后的烟丝样品在25 ℃、相对湿度65%条件下平衡24 h，卷制成卷烟。由具有卷烟感官评吸技术资格的7人组成感官评吸评委组采用整体循环法进行感官质量综合评价^[17-18]。

1.5  理化指标和致香成分测定

理化指标检测：参照行业标准YC/T 159—2002、YC/T 160—2002、YC/T 162—2002、YC/T 173—2003 及YC/T 161—2002对烟丝中总糖和还原糖、烟碱、氯、钾和总氮进行检测。

致香成分测定：挑选重量、吸阻符合要求的烟支，在标准抽吸条件下通过吸烟机抽吸，对样品主流烟气中的粒相物用滤片进行捕集，将滤片捕集物萃取浓缩至一定体积后进行GC/MS分析。GC/MS色谱条件：

色谱柱：DB-35MS弹性石英毛细管柱（60 m × 0.32 mm × 0.25 μm）;进样量：1 μL;进样口温度：240 ℃;载气：He;流速：1 mL/min;接口温度：

250 ℃;升温梯度：从初始温度50 ℃保持2 min，以3 ℃/min升温至160 ℃，保留1 min，再以4 ℃/min升温至280 ℃，保留时间20 min;离子源：EI源;电子能量：70 eV;扫描范围：35～455 amu;图谱库：NBS，WILEY标准谱库。

1.6  烟叶微生物的鉴定

唯一碳源利用试验参考张纪忠^[19]的方法，常用碳源按1%比例加入基础培养基中。采用酶法提取菌株DNA，扩增16S rRNA基因序列，（通用引物：27F，5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1492R，

5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。将测序结果在EzBioCloud库中比对，Clustal X 2.1进行同源性分析，Mega 5构建系统发育树（Neighbor-Joining法）。

1.7  数据处理及统计分析

试验数据采用Microsoft Excel和DPS 7.05软件进行数据整理及统计分析。

2  结  果

2.1  样品中微生物分离与鉴定

从供试烟叶和土壤样品中共分离得到可培养细菌284株，真菌65株，放线菌102株，细菌数量最多，故细菌为样品中的优势微生物类群。

提取细菌菌株DNA，扩增16S rRNA基因序列（图1），进行同源性比对去重后为96种细菌。核苷酸序列比对结果表明，从供试烟叶和土壤样品中分离得到的可培养细菌主要包括Bacillussp.、Chryseobacteriumsp.、Enterobactersp.、Erwiniasp.、Paenarthrobactersp.、Pseudomonassp.等27个不同的属。其中芽孢杆菌属（Bacillussp.）包含有34个不同的种，数量最多，出现频次较高的有：B. altitudinis、B. JH792383_s、B. muralis、B.CP013984_s、B. halotolerans、B. subtilis subsp.Inaquosorum、B. aryabhattai、B. megaterium、B. weihenstephanensis、B. zhangzhouensis等。从而确定芽孢杆菌属（Bacillussp.）为云南烟叶和土壤样品中可培养细菌中的优势种群。

2.2  菌株的产酶和降解特性筛选

产酶和降解特性筛选试验表明（图2），多数细菌具有产胞外酶功能，但产酶功能不同，其中6株酶活性表现较好的菌株如表1所示。供试6株菌均可产淀粉酶，其中菌株YN10产淀粉酶能力相对较强，其酶活比值达2.17，远高于其余菌株;具产蛋白酶功能的菌株为YN14、YN15和YN17;具产纤维素酶功能的菌株有YN10、YN11、YN14和YN16，其中产纤维素酶能力最强的为YN14，其酶活比值达5.00;表中6株菌均可降解β-胡萝卜素，其中降解效果最好的为YN15，降解率达39.39%。菌株YN14同时具备产3种酶的能力，并可降解β-胡萝卜素，综合表现最好。

2.3  菌株发酵后烟叶感官质量变化

由表2看出，不同菌株对烟叶感官质量各指标影响存在一定差异。与对照相比，菌株YN10和YN15可增加烟气香气量，但香气质与对照未见有明显提升，且余味有不舒适感;菌株YN11和YN17处理样烟气的细腻度和香气质有改善，但烟气浓度和香气量与对照相比有下降，且YN17处理样的烟气对喉部刺激性较大，余味改善不明显;YN16处理样与对照相比香气质稍有改善，但喉部刺激和余味不舒适感增加。综合比较，菌株YN14处理样与对照相比烟气细腻度改善，香气质和香气量均有增加，甜感有增加，刺激性减小，总体感官质量提升最为明显。

2.4  菌株发酵后烟叶化学成分和香味成分变化

如表3所示，与对照相比，经各增香菌株发酵后，烟丝化学成分中总糖、还原糖、总氮含量有明显变化，烟碱、氯和钾含量变化不大。其中，菌株YN15、YN14和YN10的总糖和还原糖含量较对照明显增加，烟叶糖碱比增高;菌株YN11和YN17的還原糖含量虽较对照有增高，但总糖含量下降;菌株YN16的总糖和还原糖含量均较对照有下降，糖碱比下降。此外，菌株YN16和YN17的总氮含量较对照稍有增加，而YN11、YN14和YN15的总氮含量较对照稍有下降。

GC/MS分析结果表明，总体感官质量提升最为明显的菌株YN14处理样和对照样的烟气中共同检测出香味化合物76种，菌株YN14处理样烟气中香味成分总含量较对照提升33.24%。如图3所示，菌株YN14在醇类、酯类、酚类、酸类、酮类、醛类和烯类香味成分含量均有增加，其中，醇类较对照提升了104.28%，酯类增加了67.29%。其中，具香味化合物如乙酸乙酯、糠醇、5-甲基-2-呋喃甲醛、2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、4-乙基-苯酚、吲哚、3-甲基-1H-吲哚、2，3-二氢-2-甲氧苯并呋喃、2，3-二吡啶、巨豆三烯酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、新植二烯、植醇、豆甾烷-3，5-二烯、豆甾醇和巨豆三烯酮等的含量较对照样有着不同程度的提高（表4）。并且，烟草常见的香味成分如巨豆三烯酮总量较对照提升了30.89%，3-氧代-α-紫罗兰醇含量提升了164.27%。

2.5  增香菌株鉴定

供试14种唯一碳源利用试验结果表明，菌株YN14可利用果糖、麦芽糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、纤维二糖、木聚糖、海藻糖、核糖、卫矛醇和肌醇作为唯一碳源生长，不能利用甘露醇和山梨醇作为唯一碳源生长。表明菌株YN14可利用碳源范围较广。

菌株YN14扩增到的16S rRNA基因序列测序片段长度为1006 bp。16S rRNA基因序列相似性比对结果表明菌株YN14和BacillusNVLJ_s相似度最高，为99.89%，与其余芽孢杆菌的相似度为99.78%或99.66%。系统发育树图中菌株YN14和BacillusNVLJ_s也处于同一系统进化分枝上（图4）。

结合菌株的生长形态、碳源利用等特性及16S rRNA序列分析结果，将产多种酶和降解特性及烟丝发酵效果均较好的菌株YN14初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）细菌。

3  讨  论

云南地区是我国重要的烟草种植区域，近年来关于该地区的烟草微生物资源研究也有报道，但这些研究多针对云南植烟区域土壤或烟叶的微生物数量、种群和部分菌株产酶特性筛选^[20-23]，而对于云南地区微生物资源应用于烟叶品质改善方面的研究报道较少。本研究不仅对云南主要典型植烟区的微生物资源进行挖掘，并对其在烟叶品质改善作用方面进行了进一步研究。

目前，将烟叶表面分离到的微生物应用于烟叶发酵中，以提高烟叶内在品质、降低烟叶有害成分，是烟草行业的热点研究方向^[24]。近年来研究表明，微生物在进行生长代谢时，可通过生物酶的催化作用直接或间接导致烟叶中物质的分解与合成，进而改善烟叶质量^[25]。与现有利用具产单一酶或降解特性的微生物^[6-9]进行发酵改善烟叶品质的研究不同，本研究从具产多种酶和降解特性的微生物及其改善烟叶整体感官质量角度开展，筛选到一株可同时产蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶并可降解β-胡萝卜素的复合功能型菌株YN14，其对烟叶品质具有明显的提升效果，这一结果也为该类研究提供了新的研究思路。

菌株YN14可能的作用机理在于，其所具备的同时产多种酶特性，在烟丝发酵过程中，可通过降解烟叶中的蛋白质、淀粉和纤维素等大分子物质，产生糖类和氨基酸等降解产物，在后续烟丝加热干燥过程中，烟丝中的糖类和氨基酸可作为反应底物经由美拉德反应^[26]使得如糠醇、5-甲基-2-呋喃甲醛、2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮等^[27]具香味的反应产物含量增加。同时，YN14菌株具有降解β-胡萝卜素的能力，而类胡萝卜素类物质是烟叶中重要的香气前体物^[28]，发酵后类胡萝卜素降解物如巨豆三烯酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、新植二烯等^[29]香味物质含量的增加，也促进了烟气的香气质量改善。此外，发酵处理后酸类、酚类、萜烯类、酯类和氮杂环类^[30-32]等不同化合物含量的增加，對香气品质提升也有一定的促进作用。总之，菌株YN14可通过上述途径，使得烟气中各类香味成分含量明显增加，这对改善烟叶感官质量起到了重要作用。

综上所述，菌株YN14具同时产多种酶的能力和降解β-胡萝卜素特性，其发酵烟样表现出感官质量明显改善和香味物质含量增加的效果。这对改善低等级烟叶品质，提高烟叶卷烟工业可用性具有重要意义。

4  结  论

本研究结果表明，在云南省典型烟草种植区烟叶和根际土壤的可培养微生物中，细菌为优势微生物类群，优势种群为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）细菌。从中筛选到一株可同时产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，降解β-胡萝卜素综合表现较好的芽孢杆菌属菌株YN14，将其应用于烟丝发酵后，对低等级烟叶感官质量指标如烟气细腻度、香气质、香气量、甜感、刺激性等方面有明显改善，提升了烟气中香味成分含量。今后将继续围绕分离到的微生物菌株开展产酶特性、发酵烟丝香气成分变化规律、感官评吸结果等方面的规律开展深入研究。

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