Cr（VI）还原微生物筛选、分离及鉴定

王思雅　左群　刘朝阳　皮海廷　李宁

摘 要：[目标]本文以分离并获得具有Cr（VI）耐受、还原能力的微生物为目标，[方法]从受污染土壤提取液中富集Cr（Ⅵ）耐受菌株，并对其进行分离、鉴定。[结果]实验共筛选出四株具有Cr（VI）耐受、还原菌株，其中2株菌株的Cr（VI）耐受能力较好，W1菌株和W3菌株。这两株菌株均能在铬浓度为100mg/L的培养液中生存，且具有一定的还原Cr的能力。[意义]这两株菌株的筛选、分离与鉴定丰富了处理铬污染微生物的生物资料，对微生物处理重金属污染具有重大意义。

关键词：铬污染;耐受菌;筛选;鉴定

Screening，Isolation And Identification of Microorganisms With Chromium Tolerance

Wang Siya1 Zuo Qun2 Liu Chaoyang 1 Pi Haiting2 Li Ning1*

1.School of water conservancy and environment HubeiYichang 443002;

2.College of biology and pharmacy，three gorges university HubeiYichang 443002

Abstract：This paper separation，screening and identification of microorganisms capable of strong resistance to chromium target.By the extract of contaminated soil Cr（Ⅵ）strains screened tolerance，and carries on the separation，Enrichment and detection of PCR.[results]a total of four tolerant strains were screened out in the experiment，but two of them were in poor growth condition，so only the W1 strains and W3 strains with good growth condition were retained.These two strains can survive in the culture solution with chromium concentration of 100mg/L.[Significance]The screening，isolation and identification of these two strains greatly enriched the biological data for treating chromium contaminated microorganisms，which was of great significance for microbial treatment of heavy metal pollution.

Key words：chromium pollution;tolerance;screening;appraisal

如今随着人们在生产生活中的快速发展，重金属Cr的污染源逐渐增多，Cr污染土地面积持续扩大，土壤Cr含量也持续增高。[1]调查报告显示，全国土壤总污染超标率为16.1%，其中Cr（Ⅵ）污染超标率已达1.1%，处于无机污染物点位超标率的前八位，污染范围较大。[2]

重金属Cr污染对人类社会有着严重的不良影响。土壤中过多的重金属进入农作物种会富集在农作物中，影响农作物的品质。同时，Cr（Ⅵ）为一种吸入性和吞入性毒物，生物富集性强，可以导致过敏、甚至遗传性基因受损，是世界癌症协会确认的重要致癌物质，[3]对人类生命安全有着巨大威胁。因此，Cr污染已经成为急需解决的问题。

近年来，我国土壤重金属污染问题逐渐显现，人们对于处理土壤重金属污染的方法也愈加关注。传统的Cr处理方法占地面积大、成本高且容易引发二次污染。

目前，有一些 Cr（Ⅵ）还原菌已经被分离出来，如Leucobacter sp.CRBl，可以在 38h 内完全还原 1820mg·L-1的Cr（Ⅵ）。[4]在韩怀芬等进行的实验中，将5种可以还原 Cr（Ⅵ）的细菌混合后对于Cr（Ⅵ）的处理能力最高能达到100%。[5]同时，微生物法处理Cr污染具有出水水质好、反应温和并且可以同时处理多种重金属的优势，因而越来越受到欢迎。[6，7]使用微生物法处理Cr需要具有强耐Cr性且具有较好的处理Cr功能的微生物菌株。而这些菌群需要我们通过筛选、分离来确定。本实验利用受到重金属Cr污染的土壤中获取的菌群提取液来进行耐Cr菌株的筛选、分离，并进行鉴定、制作系统发育树。

1 材料与方法

本次实验所用接种液是通过从受到重金属Cr污染的土壤中获取的菌群进行液体培养、并在4摄氏度冰箱保存15天所得，各项生化性质良好。

耐铬菌株的筛选、分离与纯化培养基采用PCS培养基，并在40℃的培养箱中进行筛选，在28℃的培养箱中进行富集培养。

1.1 菌株筛选

用灭过菌的100mL锥形瓶从发酵罐内取得少量发酵液。用无菌水稀释至10-4、10-5、10-6、10-7。

取一支0.5mL無菌移液管，从浓度小的10-7菌液开始，以10-7、10-6、10-5、10-4为序，分别吸取0.5mL于培养皿内，并做好标记。每次吸取前，使菌液充分混匀。

将已融化并冷却至50℃左右的培养基倒入培养皿，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于40℃恒温培养箱内培养并观察结果。

1.2 菌株富集

将已经分离得到的单菌株样本，进行3至4代的传代培养，至没有其他杂菌的存在。再进行多批量的划线培养，生长2到4天后作为菌种保存于冰箱。

1.3 耐Cr菌株的鉴定

观察筛选菌株的菌落大小、菌落表面以及颜色等形态特征。并对菌株进行革兰氏染色，确定菌株的革兰氏阴阳性。最后对菌株进行PCR鉴定，分析其同源性，制作系统发育树。

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离

通过使用PCS培养基对菌群中的细菌进行筛选后，我们共获得了四种对高浓度Cr（VI）离子具有耐受性的菌株。并对获得的菌株进行分离、富集培养，编号1～4号菌。

2.2 菌株的形态特征

1号菌培养24h后，可在平板上观察到白色芝麻大小的菌落。72h后，可在平版表面观察到绿豆大小呈凸出状的白色不透明菌落。生长状况良好，易于观察和取样。

2号菌培养24h后，可用肉眼观察到有数量较少的扁平透明的菌落出现。72h后，菌落由扁平透明变为绿豆大小的白色不透明菌落，数量明显增加。生长状况良好，易于观察和取样。

3号菌培养24h后，难以用肉眼观察到明显菌落。48h后，可观察到有数量较多的呈辐射状生长的白色透明菌落。72h后，菌落呈黄豆大小的白色透明菌落，菌落边缘出现褶皱。菌落数量少于1号菌和2号菌，生长状况一般。

4号菌培养24h后，基本无明显菌落。48h后可观察到芝麻大小的白色透明菌落。72h后，菌落数量增加，但菌落大小基本无变化。菌落数量多于3号菌，但少于1号菌和2号菌。

（a）（b）

（c）（d）

a：1号菌平板;b：2号菌平板;c：3号菌平板;d：4号菌平板

图1 菌株的平板图

2.2 菌的生长情况预实验

对菌种的生化特性进行研究前，设置了对比菌种生长状况的预实验。将4种细菌分别接种到pH=8.5的含100mg/L Cr（VI）PCS液体培养基内，置于28℃培养箱中进行培养，每24h测定一次细菌浓度。

图2 菌株的生长状况

由预实验可知，1号菌和2号菌生长状况较好，72h时，最大菌浓可达到0.35以上。而3号菌和4号菌生长状况一般，96h最大菌浓仅为0.135，表现出3号菌和4号菌对于环境的适应能力较差。故对于生物理化性质的研究及鉴定等仅考虑1号菌和2号菌。

2.3 生物鉴定

对于1号菌和2号菌，抽取总DNA，针对16S rDNA进行进行PCR检测，所獲得的DNA片段进行测序。测序结果在NCBI上进行BLST，并根据BLST结果利用MEGAX绘制系统发育树。结果如图3，1号和2号细菌同属于Delftia属微生物，该类微生物的部分菌株在还原重金属中发挥作用。

图3 菌株的生长发育树

3 结论

本实验通过对菌群的筛选与分离获得4株耐铬菌株，并通过观察单菌生长，选择对环境适应性较好的1号菌和2号菌作为研究菌株。并将1号菌株和2号菌株分别命名为W1与W3。W1菌和W3菌具有良好的耐铬性和还原铬的能力，它们能够在100mg/L Cr（VI）的培养液中良好生长。耐铬菌株的分离与发现丰富了处理铬污染微生物的生物资料，对微生物法处理重金属污染具有重大意义。

参考文献：

[1]魏超，等.重金属污染土壤微生物的分离与研究[J].山西农业科学，2018.46（10）：1691-1694.

[2]刘佳麟，张家铜.土壤重金属污染的现状及其治理[J].山东工业技术，2019：229.

[3]杨璐，胡澄.铬污染水体修复技术研究进展[J].广西轻工业，2008（07）：96-97.

[4]朱文杰，Leucobacter sp.CRB1菌还原铬（VI）的机理及其在铬渣解毒中的应用[M].

[5]韩怀芬.生物法修复铬污染土攘的研究[J].能源环境保护，2003.17（2）：7-9.

[6]刘玉玲，铁柏清.镉污染土壤的微生物修复技术研究进展[J].第六届重金属污染防治及风险评价研讨会暨重金属污染防治专业委员会2016年学术年会.中国福建厦门，2016，7.

[7]周启星，王新.重金属与土壤微生物的相互作用及污染土壤修复[J].环境污染治理技术与设备，2004.5（11）：1-5.

作者简介：王思雅（1999-），女，本科，研究方向为环境微生物学。

通讯作者：李宁（1978-），女，副教授，研究方向为环境微生物学。