IL28RA真核表达载体的构建和对HaCaT细胞迁移能力的影响

2019-12-06尹雪莉张胜权张学军

安徽医科大学学报 2019年11期

尹雪莉，张胜权，张学军

银屑病(psoriasis，Pso)确切的病因和发病机制至今仍未完全阐明，是皮肤科领域亟待解决的难题之一[1-5]。全基因组关联分析研究(genome-wide association study，GWAS)成为发现复杂疾病易感基因最常用的方法之一。GWAS发现大量Pso易感基因，其中具有免疫功能的白介素28受体ɑ(IL-28 receptor α，IL28RA)基因为中国汉族人Pso和系统性红斑狼疮共有易感基因，也是欧洲人群Pso的易感基因[6-7]。IL28RA在正常皮肤组织呈中度表达，在原代角质形成细胞和永生HaCaT角质形成细胞中高表达[8-9]。既然IL28RA是Pso易感基因，因此，IL28RA基因可能在Pso发生发展中扮演很重要的角色。该研究通过构建pCMV6-IL28RA重组体并转染HaCaT细胞，建立IL28RA过表达细胞模型进而观察IL28RA对HaCaT细胞迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞、质粒和细菌 pCMV6质粒(cat. no. PS100001)购自美国OriGene公司；E.coliDH5α感受态细菌由本实验室保存；HaCaT细胞购自中科院上海细胞库。

1.1.2主要试剂琼脂糖凝胶回收试剂盒购自美国Promega 公司；Lipofectamine 3000 Transfection Reagent购自美国Invitrogen 公司；限制性内切核酸酶HindⅢ、XhoⅠ、T4 连接酶、Trizol 试剂、逆转录试剂盒、DNA Marker、SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自日本Takara公司；PCR引物及RT-qPCR引物由上海生工生物公司合成；G418购自美国Sigma公司；DMEM 培养基、胰酶和胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1引物设计和HepG2细胞培养及总RNA提取根据NCBI Genbank 序列提供的人IL28RA mRNA 序列利用primier 5.0 软件设计引物，上游引物：AGAATGTGACGCTGCTCTCC；下游引物：GCCGGCTCCACTTCAAAAAG。HepG2细胞培养及总RNA提取：复苏HepG2细胞，将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中用含10% 胎牛血清和1%的青霉素、链霉素双抗培养基培养，待其融合80%，弃培养基用2 ml PBS洗3次后加入1 ml Trizol试剂，放置于冰上裂解，提取细胞总RNA。

1.2.2总RNA逆转录成cDNA和PCR扩增IL28RA 利用逆转录试剂盒将上步总RNA逆转录成cDNA。该方法分2步：① 逆转录加入0.5 μl Oligo dTPrimer，0.5 μl dNTP Mixture，4 μl RNA，无RNase 水4 μl，70 ℃ 15 min 并迅速放置于冰上；② 上述变性反应液中加入5×PrimeScript Buffer 2 μl，RNase Inhibitor 0.25 μl，PrimeScript RTase 0.5 μl，无RNase 水2.15 μl。点动离心，30 ℃、10 min，42 ℃、60 min，70 ℃、15 min。待反应结束后将其放置在-20 ℃冰箱中备用。PCR扩增IL28RA：依次加入2 μl cDNA，10×PCR Buffer 2.5 μl，0.5 μl上游引物，0.5 μl下游引物，MgCl21.5 μl，2.5 μl dNTP Mixture，TaqDNA Polymerase 1 μl，14.5 μl去离子水。94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，40 ℃、30 s，72 ℃、2 min，进行35 个循环，72 ℃、5 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物。

1.2.3真核表达载体构建分别用限制性内切酶HindⅢ、XhoⅠ将IL28RA的PCR片段和质粒pCMV6进行双酶切，纯化回收、连接。琼脂糖凝胶电泳检测酶切实验结果并进行胶回收。回收的酶切产物按质粒pCMV6和IL28RA PCR产物1 ∶8的比例加入T4连接酶体系，在15 ℃条件下连接过夜。将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细菌中，并涂布在固体LB 平板(25 μg/ml卡那霉素)上生长，观察平板菌落并挑取单克隆菌落接种于 LB 液体培养基中进行37 ℃振荡过夜，用基因组DNA提取试剂盒提取质粒pCMV6-IL28RA，并酶切，电泳鉴定和采取1.5 ml细菌培养物送至上海生工生物公司测序。

1.2.4重组质粒转染HaCaT细胞待HaCaT细胞生长良好时，将其种入24孔板，每孔1×105个细胞。待其融合80%时先换成无抗生素无血清的DMEM 并利用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 分别将对照pCMV6 和重组IL28RA 质粒转染HaCaT细胞，6 h 后换成完全DMEM 培养基。48 h 后加入终浓度为400 ng/ml 的G418 进行筛选，每2 d 换1次培养基，4周后可观察到空白对照组细胞全部死亡，而转染对照质粒组、过表达组细胞瓶中仍有细胞存在，说明稳定转染成功。细胞培养瓶中维持400 ng/ml G418 培养转染成功的细胞。

1.2.5RT-qPCR法检测IL28RA mRNA相对表达水平将HaCaT未转染细胞、转染对照质粒pCMV6 和过表达质粒 pCMV6-IL28RA的细胞分别接种24孔板(细胞接种密度为1×105)，当细胞融合70%～80%时，用Trizol试剂提取每种细胞总RNA测定总RNA浓度，根据RT-qPCR说明书进行检测，甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)(上游引物：AGATCATCAGCAATGCCTCCTG，下游引物：ATGGCATGGACTGTGGTCATG)作为内参对照。反应体系为20 μl：2×SYBR Mix 10 μl，DEPC H2O 8 μl，cDNA 1 μl，上下游引物分别各0.5 μl。于7500 qPCR 系统：95 ℃预变性5 min、95 ℃变性 15 s、60 ℃退火20 s、72 ℃ 2 min，共40个循环。采用2-ΔΔCt进行两组间IL28RA mRNA相对表达量计算。

1.2.6伤口愈合法检测IL28RA对HaCaT细胞迁移能力影响将HaCaT未转染细胞，转染对照质粒pCMV6细胞和过表达pCMV6-IL28RA的细胞分别种于12孔培养板中以5000细胞/ml铺板两块。孵育细胞24 h，使用10 μl无菌移液管尖进行划痕，产生汇合单层伤口，形成伤口后分别在0 h和48 h拍摄照片。

2 结果

2.1 IL28RA基因编码序列的获得从HepG2细胞中提取RNA进行逆转录，然后利用引物扩增出 IL28RA的编码序列，全长1 563 bp，见图1A。

2.2 IL28RA真核表达载体的构建及鉴定获取IL28RA基因全长后，经酶切、连接、转化。挑取单克隆菌落进行PCR及扩大培养后进行酶切并测序。酶切质粒得到5 000 bp左右pCMV6条带及1 563 bp左右的IL28RA 条带，见图 1B。经NCBI blast 比对证明质粒测序结果正确，见图1C。

2.3 RT-qPCR法分析转染后IL28RA mRNA在HaCaT中表达情况及分析其对HaCaT细胞迁移能力影响将未转染HaCaT细胞、转染对照质粒pCMV6细胞和过表达pCMV6-IL28RA的细胞接种12孔板，至90%融合时，收集细胞并提取细胞RNA，结果显示与对照组pCMV6相比，过表达组IL28RA mRNA相对表达水平(0.751 7±0.050 7)高于pCMV6对照组(4.442 0±0.621 1)，差异有统计学意义(t=4.032,P<0.05)。细胞伤口愈合实验表明，过表达IL28RA组(68.543 3±3.946 1)48 h细胞迁移未愈合面积百分比大于pCMV6组(42.786 7±2.049 7)和HaCaT组(50.913 3±2.413 6)，差异有统计学意义(F=79.01,P<0.01)，同时也表明IL28RA基因过表达使得HaCaT细胞迁移减慢。见图2。

3 讨论

Pso是一种以表皮角质形成细胞过度增殖为特征的慢性炎症性皮肤病，影响世界总人口数2%左右[10]。GWAS发现IL28RA是中国汉族人Pso易感基因，但该基因在Pso中发病机制尚不明确[7]。IL28RA基因的蛋白质产物属于Ⅱ类细胞因子受体家族[11]。人类IL28RA在膀胱癌、白血病、乳腺癌、头颈癌和肺癌组织等中表达，在人类的免疫系统呈中度表达[8]。Meta分析IL28RA基因在癌症的预后价值，研究[12]显示IL28RA在癌症中表达越低，患者预后越差。IL-29、IL-28A、IL-28B结合到该受体上，能诱导构象变化促使其与另一个受体IL10R2形成受体配体复合物，激活激酶/信号转导与转录因子信号通路，发挥干扰素λ抗病毒、抗增殖功效[9]。Dumoutier et al[13]研究显示IL-29抗增殖及抗病毒作用取决于IL28RA络氨酸343和517两个位点，当受体两位点处络氨酸突变为苯丙氨酸，IL-29抗增殖及抗病毒作用消失。因此，IL28RA在IL-29抗病毒和抗增殖中起着决定性作用。由此可见，IL28RA可能对细胞的功能有重要的调控作用(如增殖、分化、凋亡等)，还可能参与机体的免疫活动调节。

图1 IL28RA 基因的扩增及重组质粒构建与鉴定

A：IL28RA基因 PCR扩增图；B：IL28RA基因重组质粒酶切鉴定图；C：重组质粒部分测序结果;M：DNA Marker；1：IL28RA基因全长 PCR 产物；2：双酶切IL28RA 重组质粒；3：双酶切 pCMV6质粒

本研究旨在通过构建IL28RA基因真核表达载体，转染使其在人永生皮肤角质形成细胞HaCaT中过表达，观察过表达IL28RA基因对HaCaT细胞迁移能力影响。首先利用基因重组技术将IL28RA基因编码区插入质粒pCMV6中，并用RT-qPCR检测转染后IL28RA基因在HaCaT细胞中的mRNA相对表达量，结果显示过表达IL28RA成功转染HaCaT细胞；随后用细胞伤口愈合实验检测IL28RA基因过表达对细胞迁移的影响，结果发现过表达IL28RA细胞，48 h后细胞迁移未愈合面积百分比大于pCMV6组和HaCaT组即与对照细胞相比，过表达IL28RA能抑制HaCaT细胞迁移。本研究中IL28RA作为细胞膜上受体，需要相应的配体刺激(如IL-29)进而发挥其功能。然而在伤口愈合实验中，加入终浓度为100 ng/ml IL-29处理细胞，同时增加IL-29浓度和作用时间(图2)，但是IL-29加入并未改变IL28RA对伤口愈合面积的影响，其中具体机制还需要进一步研究。本研究为进一步探讨IL28RA生物学功能及其在Pso中发病机制研究奠定了基础。