FAT4的表达对人卵巢癌细胞增殖和侵袭的影响

陈 颍，周家德，颜士杰，肖 兰

卵巢上皮性肿瘤是女性生殖系统最常见的卵巢肿瘤，一经确诊超过70%已是中晚期，从而导致了易复发、预后差以及病死率高等特点，因此，找寻与卵巢癌发生、发展相关的诊断指标对深入了解卵巢癌的发病机制具有重要的意义。

人类的FAT4亦称之FAT-J，于2004年首次报道[1]，FAT4是一种单跨膜蛋白受体，与调控哺乳动物的细胞分化、组织发育相关。研究表明，FAT4蛋白在食管癌[2]、肝癌[3]中表达均显著降低；在胃癌中，FAT4低表达可导致胃癌细胞增殖[4]；另有报导，乳腺癌中FAT4表达缺失与FAT4启动子甲基化有关[5]；Bossuyt et al[6]报道，FAT4作为一个细胞黏附蛋白可影响细胞的迁移运动。国内外对FAT家族的研究主要集中于FAT1，而对FAT4研究较少，目前对于FAT4与卵巢恶性肿瘤的研究几乎未见报道。本实验应用免疫组化法比较正常卵巢组织及上皮性卵巢癌组织中FAT4表达，及其与临床病理特征间的联系；FAT4体外干预对上皮性卵巢癌细胞增殖和侵袭力的影响，以探讨上皮性卵巢癌发生发展与 FAT4 表达的相关性。

1 材料与方法

1.1 病例资料及试剂选取2016年1月～2018年12月在安徽医科大学第一附属医院病理确诊上皮性卵巢癌的石蜡标本60例 (患者术前均未行放化疗或生物治疗)，分为实验组及对照组。实验组：年龄48～55(52.21±2.82)岁，其中Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期42例。卵巢肿瘤按照WHO组织学分级标准分为：浆液性腺癌25例，黏液性腺癌27例，其他类型8例；对照组：年龄47～53(50.07±3.74)岁，同期因非卵巢疾病手术患者的正常卵巢组织30例。所有入组患者均为初诊且临床病例资料完整，均知情并签订知情同意书。A2780购自上海慧颖生物有限公司；RPMI-1640细胞培养基购自美国Hyclone公司；FAT4兔抗人多克隆抗体购自英国Abcam公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天公司；TRIzol(总RNA抽提试剂) 购自美国Gibco公司；脂质体Lipofectamine2000 购自美国Invitrogen公司；FAT4- siRNA购自美国Santa Cruz公司；PVDF膜购自美国Millipore公司。

1.2 免疫组织化学方法检测FAT4蛋白将患者的临床病理资料，如年龄、月经情况、病理类型、肿块大小、临床分期、肿瘤分级与FAT4表达进行比较。免疫组织化学方法进行FAT4检测，所有石蜡块标本均连续切片，切片厚度4 μm，切片先行抗原修复，再经脱蜡、脱二甲苯、3% H2O2封闭和枸橼酸修复液微波修复，FAT4一抗浓度以1 ∶150稀释， 4 ℃孵育过夜，次日常规复温，抗兔二抗以1 ∶2 000稀释，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，滴加5% DAB显色。再经苏木精复染、乙醇化、脱水以及中性树胶封片固定，室温风干后光镜下观察。细胞质、细胞核中为棕褐色细颗粒状为阳性。结果判定FAT4蛋白阳性表达为细胞质或核呈棕黄色颗粒，每例样本随机观察10个高倍视野(×200)，镜下无阳性细胞为阴性(-)，阳性细胞数<5%为弱阳性(1+)，阳性细胞数5%～25%为阳性(2+)，阳性细胞数>25%为强阳性(3+)。

1.3 细胞培养和转染A2780细胞于含10%小牛血清RPMI1640培养液、37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，待细胞汇合度达到70%左右时行转染，实验分3组：未转染组(空白对照组)、FAT4-NC组、FAT4-siRNA组，具体转染步骤按Lipofectamine 2000试剂说明书上操作，转染4 h后更换为1640完全培养液，继续培养48 h，分别提取RNA及蛋白用于Q-PCR及Western blot检测FAT4抑制情况。

1.4 FAT4基因在mRNA水平检测TRIzol提取细胞总RNA，定量后取2 μg反转录获得cDNA。SYBR GREEN荧光实时定量q-PCR方法进行检测FAT4基因表达情况。FAT4上游引物序列：5′-ATTTAGGACCAGAAGCGAGAA-3′，下游：5′-CTCTCCACTTTCCCAGCAA-3′；β-actin上游引物序列：5′- GTGGCCGAGGACTTTGATTG -3′；下游5′- CCTGTAACAACGCATCTCATATT -3′。反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸1 min，共40个循环。设3个复孔，所有反应进行3次，2-ΔΔCT法分析A2780细胞中FAT4基因表达情况及siRNA对FAT4基因的敲除效果。

1.5 Western blot检测细胞FAT4蛋白表达30 μg蛋白质样品行SDS-PAGE电泳，湿转至硝酸纤维膜上；5% BSA室温封闭2 h，0.05%Tween20的TBS缓冲液(TBST)漂洗3次，每次10 min；加入FAT4一抗(1 ∶500)，GAPDH一抗(1 ∶5 000)，4 ℃过夜，1×TBST漂洗3遍，相应辣根过氧化物酶标记二抗(1 ∶5 000) 37 ℃摇床温育2 h，ECL显色曝光，采集照片。

1.6 CCK-8法检测各组细胞的增殖情况PBS洗涤细胞，0.25%胰酶消化细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×104/ml，100 μl/孔接种于96孔板，设5个复孔。接种后继续培养48 h，每孔更换新鲜培养基，各加入10 μl/的CCK-8，继续培养4 h后，酶标仪检测450 nm波长处各孔吸光度OD值。重复3次，取平均值。

1.7 体外侵袭实验常规洗涤消化细胞制备单细胞悬液，无血清培养基重悬细胞，上室加入细胞浓度为8×103/ml的细胞悬液200 μl，下室加入含100 ml/L小牛血清的培养基500 μl。放置37 ℃培养箱培养48 h，取出小室，乙醇固定，结晶紫染色，风干镜检，混匀后计数下室细胞数。

2 结果

2.1 上皮性卵巢癌组织过表达FAT4免疫组化显示FAT4主要表达于上皮性卵巢癌细胞质及胞核，表现为棕黄色颗粒，着色明显，正常卵巢上皮细胞几乎不着色。相比较正常卵巢上皮组织，上皮性卵巢癌组织中显著高表达FAT4，FAT4蛋白阳性表达率相比(71.7%vs16.7%)，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图1、表1。

2.2 FAT4表达与上皮性卵巢癌临床病理的关系FAT4表达与上皮性卵巢癌患者的年龄、月经情况、病理类型无明显相关性(P>0.05)，而与上皮性卵巢癌肿瘤大小(P=0.020)、FIGO分期(P=0.002)以及病理分级(P=0.029)有明显相关性(P<0.05)，见表2。

图1 FAT4蛋白表达 ×200

A：FAT4在正常卵巢上皮细胞中表达为(-)；B：弱阳性(1+)；C：阳性(2+)；D：强阳性(3+)

表1 正常卵巢上皮及上皮性卵巢癌组织中 FAT4阳性表达率比较(n)

表2 FAT4表达与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系

2.3 siRNA对A2780细胞FAT4 mRNA及蛋白表达的影响A2780细胞转染48 h后，Western blot结果显示：细胞转染后48 h，FAT4-siRNA组较对照组及FAT4-NC组FAT4蛋白表达明显下调(P<0.05)，见图2；实时荧光定量PCR检测发现FAT4 -siRNA组FAT4 mRNA水平相比较FAT4-NC及对照组亦明显下调(P<0.05)，见图3。

图2 细胞中FAT4蛋白表达比较1:对照组; 2: FAT4-NC组; 3: FAT4-siRNA组

图3 细胞中FAT4 mRNA相对表达量比较

1:对照组; 2:FAT4-NC组; 3:FAT4-siRNA组;与对照组比较：*P<0.05；与FAT4-NC组比较：#P<0.05

2.4 FAT4-siRNA对A2780细胞增殖的影响转染48 h后，FAT4-siRNA组A2780细胞增殖较对照组及FAT4-NC组细胞增殖明显受到抑制(P<0.01)。见图4。

图4 CCK-8法检测A2780细胞增殖情况

1:对照组; 2: FAT4-NC组; 3: FAT4-siRNA组;与对照组比较：**P<0.01；与FAT4-NC组比较：##P<0.01

图5 各组细胞的侵袭能力 结晶紫染色×400 1：对照组; 2: FAT4-NC组; 3: FAT4-siRNA组

2.5 FAT4-siRNA对A2780细胞侵袭的影响镜下检测结果显示FAT4-siRNA组穿过微孔膜的细胞数目明显少于对照组及FAT4-NC组，见图5；经统计学分析，FAT4-siRNA组同其他两组间存在显著差异(P<0.01)，见图6。说明FAT4基因促进了人卵巢癌细胞A2780的体外侵袭能力。

图6 穿过微孔膜A2780细胞百分比比较

1：对照组; 2: FAT4-NC组; 3: FAT4-siRNA组;与对照组比较：**P<0.01；与FAT4-NC组比较：##P<0.01

3 讨论

人类FAT基因是果蝇ft基因的同源基因。ft基因通过参与调控Hippo通路和影响平面细胞极性在果蝇的整个发育过程发挥重要调节作用。近来年，关于FAT基因家族的研究才广泛开展起来。从蛋白组织观点看，FAT蛋白的分子量是钙黏超家族中最大的一类，作为一种单次跨膜受体蛋白，由32～34次重复钙黏蛋白组成。

FAT家族主要包括FAT1、FAT2、FAT3、FAT4蛋白4个重要成员。已经证实FAT1和FAT4与肿瘤发生发展有关。FAT4在胃癌、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤的表达率显著低于正常组织，表现为抑癌基因作用；Cai et al[7]研究提示FAT4蛋白在胃癌组织中表达下调，FAT4 mRNA表达也显著低于癌旁组织，且FAT4阴性表达与胃癌淋巴结转移、短生存期密切相关；细胞水平也证实低表达FAT4可促进胃癌细胞发生侵袭转移，提示FAT4是一个抑癌基因；Sun et al[8]报道外周血中异常FAT4甲基化与胃癌高风险有关。而FAT4是否具有癌基因功能目前尚未见报道。

人们已发现在FAT四个亚型中，FAT1亚型既有抑癌作用又有致癌作用。在直肠癌、神经胶质瘤和头颈部肿瘤中FAT1表达下调，但在乳腺癌、白血病和黑色素瘤中FAT1表达却为上调[9-10]。那么FAT4基因是否也具有这种双重特性呢？笔者发现与正常卵巢上皮组织比较，上皮性卵巢癌中FAT4高表达，提示FAT4高表达与上皮性卵巢癌发生有关；FAT4表达与上皮性卵巢癌患者年龄、病理类型无明显相关，而与肿瘤大小、FIGO分期以及病理分级明显相关。随着上皮性卵巢癌FIGO分期提高，FAT4阳性表达率明显升高，且上皮性卵巢癌分期越晚，FAT4阳性表达率越高，提示FAT4过表达与上皮性卵巢癌的发生发展呈正相关，FAT4过表达可能促进肿瘤增殖，导致肿瘤体积增长较快，推测FAT4可能是卵巢肿瘤癌基因的候选者之一。

相关机制研究[11]发现FAT4表达缺失可使Hippo通路中断，进而导致乳腺肿瘤形成，当小鼠FAT4表达恢复后其致瘤性明显下降，提示FAT4通过Hippo信号通路在乳腺癌中起到抑癌基因作用。Bossuyt et al[6]发现FAT4敲除并未使小鼠肝脏形成肿瘤，FAT4未起到肿瘤抑制作用。该研究推测在不同组织中FAT4与Hippo通路互作不同。在结肠癌中FAT4通过调节PI3K-AKT信号传导通路[12]，抑制上皮间质转化，从而进一步抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭能力。与FAT4敲除小鼠相比，FAT4过表达小鼠的结肠肿瘤明显缩小。本实验结果显示FAT4基因在上皮性卵巢癌A2780细胞中高表达，FAT4-siRNA转染A2780细胞沉默FAT4基因后，A2780细胞的增殖和侵袭能力明显受到抑制，而其作用机制尚需更多深入的研究进一步验证。

卵巢癌的发生发展是多因素共同参与的过程，通过各种信号调节通路相互协调制约。本研究结果发现FAT4与卵巢癌细胞增殖及侵袭相关，下一步将深入研究FAT4通过激活哪些信号促进肿瘤生长和肿瘤迁移及其具体分子机制，为寻找有效的治疗卵巢癌的分子靶点提供前期研究及理论基础。