酶标仪法测定发酵液中谷胱甘肽的含量
2019-12-05张恩芬周建宝费芙蓉薛正莲
张恩芬，查 飞，周建宝，费芙蓉，王 洲，薛正莲
谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一种谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸缩合而成的一种含γ -谷氨酰基和巯基的三肽类化合物，具有清除自由基、延缓衰老、解毒等多种生理功能[1-3]，在临床上可以用来肝脏保护[4]、治疗肿瘤和治疗内分泌紊乱等疾病[5-6]，同时还广泛应用于食品、医药等相关领域。因此，全世界科学家研究的热点已转向GSH[7]。目前对谷胱甘肽测定方法有分光光度法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、酶循环法等[8]，但成本高、耗时长，不适用于大批量样品的定量检测已成为上述方法的缺点。
可见分光光度计是常用于化合物的检测，酶标仪是常用于酶联免疫的测定[9]，测定物质含量二者均服从朗伯-比尔定律：物质在一定波长处的吸光度和浓度之间存在线性关系，目的是实现对化合物定量的检测。可见分光光度计法影响因素少，操作繁琐，试剂用量大，耗时长；酶标仪影响因素多，但速度快，效率高，试剂用量少，适用于大批量样品的快速检测[10]。
考虑到菌种选育过程中，产GSH毕赤酵母突变株的数量较多，通过孔板发酵的样品多，寻找一种快速、高效、精确的测定方法非常重要。本实验采用酶标仪法测定GSH含量，并与分光光度计法进行了比较，用Origin软件对2种方法进行拟合分析，显示2 种测定方法具有很好的一致性。到目前为止，尚未见有关酶标仪测定GSH含量方面的相关研究，酶标仪法能够简单、高效、精确地测定发酵液中GSH含量，为高通量选育GSH酵母菌提供了理论基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器
还原型谷胱甘肽(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；甲醛(分析纯)，南京化学试剂有限公司; 盐酸(分析纯)，南京化学试剂有限公司；Tris(生化试剂) ，生工生物工程股份有限公司;2-硝基苯甲酸(DTNB)标准品(生化试剂) ，生工生物工程股份有限公司; FC型酶标仪，Thermo Fisher Scientific; 常温室压等离子体(ARTP) ，北京思清源生物科技有限公司; 单道手动可调移液器，Sartorius; 723N 可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司; Sorvall ST 16R Centrifug，Thermo Fisher Scientific。
1.2 菌种
毕赤酵母：本实验室保藏。
1.3 培养基及试剂
1.3.1 培养基
种子/斜面培养基(g/L)：葡萄糖20、胰蛋白胨20、酵母粉10，pH6.0。115°C，灭菌25 min。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖30、酵母粉12.5，(NH4)2SO45，KH2PO49，MgSO4·7H2O 1.0， 用NaOH调pH至5.0-5.5。115°C，灭菌25min。
1.3.2 试剂
Tris-HCl缓冲液(ph8.0)；3%甲醛；0.1 mmoL/L DTNB： 称取 0.3964g DTNB 溶于 0.05mol/L磷酸盐缓冲液，定容至 100m L，储存于棕色瓶，低温保存；DTNB分析液：0.01mol/L DTNB 和 0.25mol/L Tris.-HCl 体积比为 1:100 混合而成，现用现配。
1.4 实验方法
1.4.1 GSH测定的原理及方法
比色法测定GSH的原理：DTNB法，还原型谷胱甘肽和5,5-二硫代双(硝基苯甲酸)反应生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸，在pH8.0，412nm波长处有最大吸收峰。同时利用甲醛掩蔽半胱氨酸等含有巯基的化合物来提高测定方法的准确性[11-12]。
测定方法：吸取样液0.5mL，分别添加0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液1.5 mL、3%甲醛0.5 mL、0.1 mmoL/L DTNB分析液2.5 mL，摇匀，25℃水浴5 min[13]，酶标仪在412nm处测定OD值。
1.4.2 谷胱甘肽含量测定中主要影响因素的优化
取0.2 g/L、0.3 g/L和0.4 g/L的GSH标准液0.5 mL，按1.4.1的测定方法对主要影响因素中的Tris-HCl缓冲液、甲醛、DTNB分析液的添加量进行优化。对Tris-HCl缓冲液添加量进行优化时0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液取值分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL；对甲醛的取值分别为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL；对DTNB分析液的取值分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL。
1.4.3 标准曲线的建立
采用蒸馏水和GSH标准液混合配制标样，见表1。精确配制0.2 g/L GSH标准液。按照优化后的方法在412nm下酶标仪和可见分光光度计分别测定并对其测定值绘制标准曲线。
1.4.4 精密度试验
按建立的方法对75 mg/L和135 mg/L的GSH标准溶液进行测定，按标准曲线的线性回归方程计算GSH的含量，并进行统计分析。
表1 标准溶液GSH和蒸馏水组成表
1.4.5 加标回收试验
分别配制2.4475、4.8950、24.475、75、135 mg/L的GSH按优化后的方法测定，并且按标准曲线的线性回归方程计算GSH的含量，然后进行统计分析。
1.4.6 两种方法的拟合曲线
将实验中通过ARTP诱变所获得的45 株毕赤酵母突变株经48孔板发酵制得的发酵液离心，取上清液1mL，按照优化后的方法，采用origin 8. 0软件拟合酶标仪与可见光分光光度计412nm下的测定值。
2 结果与讨论
2.1 Tris-HCl 缓冲液添加量的影响
按照方法1.4.2见图1。
图1 Tris-HCl缓冲液添加量对OD412的影响
如图1所示，随着Tris-HCl缓冲液的添加量的增多，OD值先是上升，出现峰值后下降，且0.2 g/L的GSH、0.3 g/L的GSH和0.4g/L的GSH都在添加0.6 mL的0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液时OD值最大，这是由于添加0.6 mL0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液所达到的pH值是DTNB反应的最适pH值，添加量过多过少都不利于反应进行，因此，本实验确定添加0.25 moL/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液0.6mL。
2.2 3%甲醛添加量的影响
按方法1.4.2所测得的结果见图2。
图2 3%甲醛添加量对OD412的影响
如图2所示，随着3%甲醛的添加量的增加，OD值逐渐下降，且不增加，且0.2g/L的GSH、0.3g/L的GSH和0.4g/L的GSH都在添加0.1 mL3%甲醛时达到最高OD值，究其原因为甲醛起到掩蔽剂的作用，掩蔽含巯基的化合物，添加量过多会影响DTNB反应，因此，本实验确定3%甲醛的添加量为0.1 mL。
2.3 DTNB分析液添加量的影响
按方法1.4.2所测得的结果见图3。
图3 DTNB分析液的添加量对OD412的影响
如图3所示，随着DTNB分析液的增加，OD值呈先增加后减少的趋势，且0.2g/L的GSH、0.3g/L的GSH和0.4g/L的GSH都在添加1.5mLDTNB分析液达到最大OD值，其原因为在DTNB反应中1.5mL DTNB分析液在一定pH条件下与GSH反应，反应效率最高。
2.4 标准曲线的建立
按方法1.4.3分别绘制可见分光光度计与酶标仪测定的GSH浓度的标准曲线，结果见图4和图5。
图4 可见分光光度计的标准曲线
图5 酶标仪的标准曲线
由图5可知，GSH的浓度在0-200mg/L范围内R2=0.9978线性关系良好，可以用于GSH浓度的测定，酶标仪检测GSH最低检出限为2.4475mg/L，即空白对照组的OD值带入标曲所得。
2.5 精密度试验
按方法1.4.精密度试验结果见表2，该方法的检测精密度在低浓度和高浓度都较好，且各组的变异系数和相对误差都在5%以下；表明酶标仪法测GSH结果重现性好，精密度高，该方法可行性高。
2.6 加标回收试验
按方法1. 4. 5所测得的结果见表3。由表可知，以检测限的10倍加标时回收率在88.36%-91.76%之间，以检测限的2倍加标时回收率在101.29%-118.32%之间，而以最低检测限加标时回收率为117.47%。考虑到加入过多或者过少的标准品，均不能保证加标样品有较好的回收率，当浓度范围为中、高浓度水平时，适用于一般的分析方法，所以，对75mg/L GSH、135mg/L GSH的加标回收率进行测定，加标回收率在98.12%-107.72%之间，表明酶标仪法可以用于GSH浓度的测定。
表3 加标回收率
2.7 两种方法的拟合曲线
按方法1. 4. 6，结果见图6。对45株毕赤酵母菌突变株的发酵液中GSH的含量分别用可见光分光光度计和酶标仪进行测定，并对二者进行拟合，验证两方法之间的相关性，拟合曲线见图6。
图6 分光光度计法和酶标仪法的拟合曲线
两种方法相关的方向取决于相关系数的正负，而相关系数的绝对值的大小决定了相关的强弱。统计学家根据经验给出了R=0.70作为一个中等到较高的相关标准[14]。本实验的样本量为45，相关系数R=0.9503，说明酶标仪法和可见分光光度计之间具有较高的正相关性，酶标仪法可以作为快速、精确的测定发酵液中GSH含量的有效方法。
3 结论
本实验用DTNB反应测定GSH含量，并用酶标仪检测，对影响该反应的主要因素进行优化。并对该方法进行精密度检验，表明酶标仪测定GSH含量的可行性高。本实验还对ARTP诱变获得的45株突变菌株分别使用可见分光光度计与酶标仪进行测定并对测定值拟合，实验结果表明2种测定方法具有很好的一致性。酶标仪能简单、高效、精确的测定发酵液中的GSH含量，为高通量选育GSH酵母菌提供了很好的理论基础。
