MicroRNA-107负向调控结核分枝杆菌牛源人型分离株介导的巨噬细胞炎症反应

朱一帆，陈颖钰，刘晗，索朗斯珠，牛家强，郭爱珍

（1.西藏农牧学院动物科学学院，林芝 860000；2.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；3.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070）

牛结核病是一种慢性消耗性人畜共患病，牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis, M. bovis）是该病的主要病原菌，其次为主要感染人结核病的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, M. tb）。大量研究显示，这两种病原菌能够在不同物种间相互传播，导致结核病的发生[1,2]。本实验室前期从一结核病牛体内分离到一株结核分枝杆菌，命名为1458株。并通过动物回复试验验证了该菌确实能够对牛致病。为深入了解该牛源人型株的致病机制，为牛及人结核病的防控提供依据，本实验室建立了基于该牛源人型株1458株的结核病感染模型，利用1458株成功感染了人巨噬细胞THP-1，对细胞内的MicroRNA（miRNA）进行了分析。

miRNA是长度仅为19～22个核苷酸的单链非编码小分子RNA，主要通过与靶标基因mRNA的3'非编码区域互补结合，从而降解靶标基因mRNA或抑制其翻译表达，进而参与调控宿主细胞增殖、分化、凋亡、坏死、自噬及个体代谢发育等生命进程[3～6]。研究表明，miRNAs在M. tb感染中通过抑制不同靶标基因的表达，调控宿主巨噬细胞的自噬、凋亡和炎症应答等多种生物学过程，进而影响M.tb的入侵和在巨噬细胞内的增殖，并可作为结核病潜在的诊断标志和治疗制剂靶位点[7～11]。

在1458株感染模型中发现，当感染有结核分枝杆菌时，miR-107表现为显著下调。报道显示，miR-107在细胞增殖、分化、侵袭、自噬和凋亡等调控中起重要作用，在肿瘤等疾病中也扮演着重要的角色[12～14]，但其在M.tb感染中的作用还未有报道。为了阐明miR-107在M.tb1458株感染中的作用及其相关机制，本研究构建了M.tb1458株与THP-1细胞体外相互作用模型及THP-1细胞过表达和抑制表达miR-107转染模型，对miR-107在M.tb1458株与巨噬细胞相互作用中对巨噬细胞炎性因子的分泌及M.tb1458株对巨噬细胞侵袭的影响进行了研究，一方面以该牛源人型株为感染模型阐明结核分枝杆菌的感染机制，另一方面也为人及动物结核病的防控提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞、细菌及培养

人急性白血病单核细胞（THP-1，ATCC ® TIB-202TM）使用含有10%澳洲胎牛血清（Gibco）的RPMI-1640培养基（Hyclone）于37℃、5% CO2条件下培养；结核分枝杆菌牛源人型分离株1458株（M.tb，北京株，NZ_CP013475.1），由本实验室分离鉴定并保存，使用含有10% OADC（BD）和0.05% Tween-80（Sigma）的7H9培养基（BD）于37℃培养，本试验中的M.tb1458株相关试验均在华中农业大学生物安全三级实验室（ABSL-3）内严格按照生物安全相关操作规程进行。

1.1.2 主要试剂

胎牛血清、HBSS缓冲液购自Gibco公司；RPMI-1640培养基购自Hyclone公司；异丙醇、吐温-80、氯仿购自国药集团；7H9、7H11培养基、OADC增菌液购自BD公司；hsa-miR-107化学模拟物、模拟物阴性对照、hsa-miR-107抑制剂和抑制剂阴性对照购自苏州吉玛公司；转染试剂INTERFERin® 购自Ployplus公司；TRizol购自Invitrogen 公司；AceQ qPCR SYBR green master mix、HiScript® Ⅱ Q RT SuperMix购自Vazyme公司；All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit购自GeneCopoeia公司；荧光定量相关引物（表1）由武汉昆泰锐公司合成。

表1 荧光定量相关引物

1.2 试验方法

1.2.1 THP-1细胞转染

THP-1细胞以5×105/孔的比例接种于12孔细胞板中，使用转染试剂INTERFERin®（8μL/孔）进行瞬时转染，miR-107化学模拟物、miR-107抑制剂、模拟物阴性对照和抑制剂阴性对照各15pg/孔，瞬时转染24h后加入佛波酯 （PMA，终浓度40ng/mL）诱导THP-1细胞贴壁12h等待感染M. tb1458株。

1.2.2M.tb1458株感染

M.tb1458株培养20d至对数生长期，取试验所需体积菌液于3 000g离心10min，弃上清，1/2离心体积的HBSS缓冲液重悬并使用胰岛素注射器充分分散4～6次后静置5min，细菌悬液的上半部分上层菌液用于后续感染。感染细菌数目根据OD600nm=0.6相当于约1×108个细菌/mL计算[18]。同时将100μL悬浮液连续稀释，并将每个梯度稀释液50μL接种到含有10% OADC的Middlebrook 7H11琼脂平板上，37℃条件下孵育14～21d计算活细菌数目（CFU/mL）。

感染时，取已测OD600nm上层菌液以MOI=10:1感染THP-1细胞12h，12h后使用新鲜RPMI-1640培养基洗涤两遍，加入含庆大霉素（终浓度100μg/mL）和10% FBS 的RPMI-1640培养基去除胞外细菌（此时定义为0h），再于0h、6h、12h、24h后收集细胞样本。

1.2.3 参与调控 miR-107表达的信号通路检测已有文献报道，NF-κB和MAPKs信号通路通过调控M. tb1458株感染的巨噬细胞中促炎或抑炎细胞因子的分泌介导巨噬细胞中M.tb1458株的存活[19～21]。为了检测这些信号通路是否参与调控M.tb1458株感染的THP-1细胞中miR-107的表达，本试验使用PI3K（10μmol/L，LY294002）、JNK（10μmol/L，PA600125）、P38（10μmol/L，SB203580）和NF-κB（20μmol/L，SC514）4个特异性信号通路抑制剂（Target Mol）分别处理PMA分化的THP-1细胞2h后如上1.2.2所述感染M.tb1458株，收集终止感染后12h的THP-1细胞样本，使用实时荧光定量PCR（qRTPCR）检测各组miR-107的相对表达量。

1.2.4 THP-1细胞内M. tb1458菌株计数

THP-1细胞转染过程同1.2.1，感染M.tb1458株过程同1.2.2。于0h，PBS洗涤两遍后每孔加入500μL去离子水，室温裂解细胞15min，分散混匀后用HBSS缓冲液梯度稀释至10-3，取100μL涂布于Middlebrook 7H11琼脂平板，37℃温箱倒置培养3周后计数，每组设置3个重复。

1.2.5 THP-1细胞RNA的提取及反转录

TRIzol（Invitrogen）法提取THP-1细胞的总RNA。用polyA加尾法（All-in-OneTMmiRNA qRTPCR Detection Kit，GeneCopoeia）进行miR反转录。

1.2.6 实时荧光定量PCR

用SYBR Green 染料法对miR-107的相对表达量进行验证，如下程序进行反应：95℃预变性5min；95℃、10s；60℃、30s，共40个循环；95℃、15s，60℃、60s，95℃、15s，收集溶解曲线信号。miRNA相对表达量检测的内参基因是U6，目的基因相对表达的定量分析采用2-ΔΔCt法（Livak），该分析的前提是假设每一个扩增循环增加1倍的目的基因数量，使用PCR反应的指数期所获取的Ct值来反映模板量的大小，Ct值相差1等于起始模板量2倍的差异。样品中靶基因的相对表达量用2-ΔΔCt表示，ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值，ΔΔCt=目的基因ΔCt值-内参基因ΔCt值。

1.2.7 数据分析

应用统计分析软件GraphPad Prism 7.0计算各组数据的平均值和标准差，各组数据以means±SEM表示，并用Student's t test 、One-way、Two-way ANOVA检验分析各组数据的均数差异显著性。P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001分别用＊、 ＊＊、 ＊＊＊ 表示。

2 结果

2.1 M. tb 1458株显著下调miR-107在巨噬细胞中的表达

本实验室前期通过R N A 高通量测序发现，M.tb1458株感染巨噬细胞系THP-1后，miR-107显著下调表达。通过qRT-PCR验证M.tb1458株、热灭活M.tb1458株（HI-M. tb 1458株）和PBS（对照，定义为1）分别处理的THP-1细胞中的miR-107表达量如图1所示。THP-1细胞感染MTB后miR-107在感染后6h、12h、24h均显著下调表达（P＜0.001），相比较热灭活的M.tb1458株处理组，M.tb1458株处理组能够诱导miR-107更为显著的下调表达（感染后6h和24h，P＜0.01）。结果表明，M.tb1458株显著下调THP-1细胞中miR-107的表达，M.tb1458株在巨噬细胞内分泌的多种蛋白可能参与调节miR-107的下调表达。

图1 qRT-PCR检测miR-107在MTB和巨噬细胞互作中的表达量

2.2 PI3K信号通路参与调控M.tb1458株感染诱导的miR-107下调表达

为了检测M.tb1458株感染中有哪些信号通路参与调节miR-107的下调表达，分别使用PI3K（10μmol/L，LY294002）、JNK（10μmol/L，PA600125）、p38（10μmol/L SB203580）和NF-κB（20μmol/L，SC514）4个特异性信号通路抑制剂预处理PMA分化的THP-1细胞后感染M.tb1458株，通过qRT-PCR检测miR-107的表达量变化。结果发现，相比JNK、p38和NF-κB信号通路，当PI3K信号通路被抑制后，miR-107下调表达的趋势被明显抑制（P＜0.05），且与对照组无显著差异（P＞0.05），表明PI3K信号通路参与调控M.tb1458株诱导的THP-1细胞中miR-107的下调表达（图2）。

图2 qRT-PCR检测参与调节M. tb 1458株感染的THP-1细胞中miR-107表达的信号通路

2.3 miR-107负向调控M. tb 1458株诱导的炎性因子表达

外源性添加miR-107模拟物和miR-107抑制剂后，通过qRT-PCR对M.tb1458株感染的THP-1细胞中IL-1β、IL-10、TNF-α和IL-6的表达量进行检测，结果如图3所示。可以看出，与对照组相比，miR-107模拟物处理组可显著抑制IL-1β（P＜0.05）、IL-10（P＜0.05）、TNF-α（P＜0.05）和IL-6（P＜0.01）mRNA水平的表达；与之相反，miR-107抑制剂处理组可显著促进IL-1β（P＜0.05）、IL-10（P＜0.05）、TNF-α（P＜0.01）和IL-6（P＜0.001）mRNA水平的表达。表明miR-107负向调控M.tb1458株诱导的炎性因子表达。

图3 miR-107模拟物抑制M.tb1458株诱导的炎性细胞因子的表达A:IL-1β检测; B:IL-10检测; C:TNF-α检测; D:IL-6检测

2.4 miR-107 抑制剂抑制M. tb 1458株对THP-1细胞的入侵

为了探究miR-107 对M.tb1458株侵袭能力的影响，THP-1细胞分别转染miR-107模拟物、miR-107 抑制剂、模拟物阴性对照或抑制剂阴性对照后感染M.tb1458株，通过CFU实验对M.tb1458株对THP-1细胞的侵袭能力进行检测。菌落计数结果显示，相比较对照组，miR-107模拟物显著促进M.tb1458株对THP-1细胞的入侵（P＜0.001）。同时，抑制miR-107后M.tb1458株对THP-1细胞的入侵明显受到了抑制（P＜0.001）（图4）。

图4 miR-107对 M.tb1458株侵袭的影响

3 讨论

结核分枝杆菌是一种能在组织细胞内大量繁殖的病原体，主要在人间传播。本实验室前期发现其对牛也有致病性，并成功在发病牛体内结核病灶中分离出结核分枝杆菌[2]。结核分枝杆菌与宿主协同进化，一方面结核分枝杆菌通过逃避宿主先天性和适应性免疫反应，以在宿主细胞（主要是巨噬细胞）的恶劣微环境中持续存活[22～25]，另一方面，巨噬细胞能够通过自噬、凋亡和炎症应答等多种生物学过程抵御结核分枝杆菌感染入侵[22,26]。miRNA是免疫应答的关键转录后调节因子，据报道，M.tb感染期间，至少有30种miRNA在巨噬细胞、树突细胞和CD4+T细胞中差异表达[27]。他们通过介导自噬、细胞凋亡、吞噬和NF-κB等先天免疫信号通路的激活来调节宿主对M.tb感染的免疫反应[10,28～30]。然而，目前还未有关于miR-107在M.tb感染中作用的报道。

本研究首次证明了M.tb1458株感染可显著下调THP-1细胞中miR-107的表达，并依赖于PI3K信号通路；进一步确定了miR-107抑制剂能够促进M.tb1458株诱导的IL-1β、IL-10、TNF-α和IL-6 mRNA水平表达，并抑制了M.tb1458株对THP-1细胞的入侵。表明M.tb1458株感染中，巨噬细胞可通过下调表达miR-107促进促炎细胞因子的分泌以募集周围的巨噬细胞抑制M.tb1458株的入侵，但其具体调控机制仍不清楚。

已有研究报道，M.tb感染中miRNAs通过调控不同靶标基因的表达，影响宿主巨噬细胞的自噬、凋亡和炎症应答等多种生物学过程[7～10]。因此，进一步鉴定miR-107的下游靶标基因有助于揭示miRNA-107 负向调控M.tb1458株感染诱导的炎症应答和促进M.tb1458株入侵的分子机制。本研究通过在线算法预测软件对miRNA-107的下游靶基因进行靶标预测，对4个软件均能预测到的102个靶标基因进行GO富集分析，发现miRNA-107的下游靶基因主要聚类到与细胞分化、泛素化和DNA损伤修复相关的信号通路中，揭示miR-107在M.tb1458株和巨噬细胞互作中可能通过调节靶标蛋白的泛素化进程来调控炎症反应、影响M.tb1458株的入侵，不过这需要进一步的研究证实。