利用分子标记技术聚合2 个白叶枯病基因改良华占的白叶枯病抗性

2019-12-05倪深夏春应建成孙红伟陈红旗

中国稻米 2019年6期

倪深夏春应建成孙红伟陈红旗

（中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室，杭州310006；*通讯作者：chqhzfy@126.com）

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国65%以上人口的主食[1]。水稻在生长过程中会遭受各种病虫害的入侵，其中白叶枯病是影响水稻产量的主要病害之一。白叶枯病菌侵害常造成水稻减产20%～40%，严重时甚至颗粒无收[2]。目前大面积推广的水稻品种多数不抗白叶枯病，用药防治效果差、成本高，且严重污染环境。培育携带白叶枯病抗性基因的水稻新品种，是控制水稻白叶枯病发生和蔓延最为经济和有效的一种途径。

20 世纪80—90年代，我国栽培稻的白叶枯病抗源主要为Xa4 和Xa3，但在栽培稻种植的过程中，有些原先无毒小种发生了变异，还有些具毒性的劣势小种上升为优势小种，导致水稻品种逐渐丧失抗性。xa5 和Xa7 等广谱抗性基因逐渐应用于改良常规稻品种和杂交稻亲本的白叶枯病抗性[3]，这2 个抗性基因源自孟加拉国的3 个品种DV85、DV86 和DZ78。xa5 定位于5 号染色体短臂末端SNPS 标记RS7 和SSR 标记RM611之间，遗传距离为0.5 cM，物理距离接近70 kb[3]，Xa7是孕穗期专抗的显性基因，定位于6 号染色体上标记GDSSR02 和RM20593 之间，遗传距离分别为0.07 cM和0.14 cM[4]。

华占是中国水稻研究所通过系统选育的籼型恢复系，具有恢复力强、配合力好、综合性状好等特点，以其为亲本已经选育了100 多个组合。但该恢复系感白叶枯病，为此，本研究利用回交结合分子标记辅助选择技术导入xa5 和Xa7 抗性基因，以提高华占对白叶枯病的抗性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

抗性基因供体亲本分别为IRBB5（xa5）、镇R084（Xa7），受体亲本为华占。在白叶枯病抗性接种鉴定中，以金刚30 作为感病对照。

1.2 试验方法

1.2.1 多态性标记的筛选

参照BLAIR 等[4-5]对抗病基因的定位结果，并结合www.gramene.org 上的分子标记整合图，分别搜索与抗病基因xa5 和Xa7 紧密连锁的SSR 标记，在供体亲本和受体亲本之间进行多态性检测，各筛选到1 对紧密连锁标记，分别为RM603 与RM20595。

1.2.2 白叶枯病抗性接种鉴定

接种用菌株分别为PXO99（P6）、CR1、ZHE173、CR6 和OS-225。PXO99 来自菲律宾，其他均由本实验室保存。

在复合杂交分离时代，仅用浙173 菌株接种。改良株系及亲本，用上述5 个菌株分别接种鉴定。

采用剪叶接种法接种病原菌，一般在接种后14～21 d 进行调查，每次3～5 张叶片。参考国际水稻研究所标准记载病情[6]。

1.2.3 农艺性状调查

表1 水稻品种成株期白叶枯病抗性鉴定

图1 RM603 检测华占/ IRBB5//华占///华占的复交BC1F1

图2 利用RM20595 检测华占/镇084//华占///华占的复交BC1F1

表2 水稻品种成株期白叶枯病抗性鉴定

华占及其改良株系B3 种植于中国水稻研究所富阳试验基地。每个小区种植6 行，每行种6 株，栽插规格为20.0 cm ×23.1 cm 。成熟期各小区材料随机取5株，在室内考察农艺性状，主要包括全生育期、株高、单株有效穗数、平均穗长、每穗总粒数、每穗实粒数、结实率和千粒重等指标，重复3 次。

2 结果与分析

2.1 亲本的白叶枯病抗性鉴定

水稻分蘖盛期至孕穗初期，在傍晚太阳西斜后，用剪叶法接种4 个水稻品种。成株期的鉴定结果表明，华占对菌种CR1 表现中抗，对其余4 个菌种表现感病或高感，有必要进行抗性改良。IRBB5 和镇084 对菌株PXO99 表现为高感，感病对照金刚30 对5 个菌株均表现感病（表1）。

2.2 华占的改良系的选育及标记辅助选择

以华占为母本，分别与含有Xa7 和xa5 基因的品系镇084 和IRBB5 进行杂交，然后再分别与华占回交2 次，回交过程中用标记RM603 与RM20595 辅助选择（图1、图2）。

在BC2F1世代，两个回交方向分别选择带有抗性基因的单株进行复合杂交，在复合杂交F2世代，用标记RM603 与RM20595 进行辅助筛选，同时接种白叶枯菌浙173，鉴定白叶枯病抗性。选择农艺性状与华占相似的，抗浙173 菌株的材料，进行3～4 代的自交，最终获得了3 个稳定纯合的株系：B1（xa5）、B2（Xa7）和B3（xa5+Xa7）。

2.3 改良株系的白叶枯病抗性评价

在水稻孕穗期用5 个菌种对改良株系进行白叶枯病抗性鉴定。结果表明，感病对照金刚30 对5 个菌系表现为感病或高感，表明接菌反应稳定，各菌株致病力正常；仅携带xa5 或Xa7 基因的改良株系B1 和B2 对菌株PXO99 均表现为高感，对其他4 个菌株都表现为抗或高抗；携有xa5+Xa7 基因的株系B3 对PXO99 表现为中感，对其他4 个菌株都表现为高抗，抗性水平明显好于仅携带单基因的B1 和B2（表2）。

2.4 改良株系B3 的主要农艺性状

从表3 可见，改良株系B3 在生育期、穗长、千粒重方面与华占相比差异不显著；每穗总粒数和每穗实粒数均比华占多，其中每穗总粒数差异显著；单株有效穗数比华占少，差异极显著。可见，改良株系B3 基本保持了华占的优良性状，白叶枯病的抗性却明显提高，在今后可以作为良好的育种材料加以应用。

3 讨论

3.1 本研究改良的杂交稻亲本的应用前景

由于华占具有配合力好、抗稻瘟病和米质优等特点，将其改造成抗白叶枯病的新品系，对培育生产上大面积推广的新组合非常有意义。目前正用大量的不育系进行测配，测配组合初步用浙173 菌株进行鉴定，表现为高抗。同时，本研究育成的一些抗白叶枯病中间材料，将是选育新的抗病恢复系的重要供体亲本。

3.2 初探聚合基因的选择

研究表明，抗性基因xa5 和Xa7 对应于病原菌中的无毒基因分别为avrxa5（avirulence, avr）和avrXa7。avrxa5 和avrXa7 均属于avrBs3/pthA 家族基因，前者102bp 的保守序列在基因内重复19.5 次，后者则重复25.5 次。无毒基因中重复结构域的交换试验表明，xa5和Xa7 只能分别识别病原菌中的avrxa5 和avrXa7，表现特异的抗病性[7]。