UPLC同时测定香加皮中六种成分△

2019-12-05姚鹏李洋杜昆泽李晋常艳旭

中国现代中药 2019年10期

姚鹏，李洋，杜昆泽，李晋，常艳旭*

1.福建省卫生健康委员会中医药管理处，福建福州 350002；2.天津中医药大学/天津市现代中药重点实验室，天津 300193

香加皮为萝藦科植物杠柳PeriplocasepiumBge.的干燥根皮，其性温，味辛、苦，有毒，归肝、肾、心经，具有祛风湿、强筋骨的功效，用于治疗风寒湿痹、腰膝酸软、心悸气短、下肢浮肿[1]。此外，香加皮还具有强心、抗炎、抗肿瘤、促神经纤维增长、诱导细胞分化的作用[2-4]。据文献记载，香加皮中含100多种化学成分，包括C21甾体类化合物、强心苷类化合物、萜类化合物、脂肪酸类及挥发油类等化合物[5-8]。其中，杠柳毒苷、杠柳苷元和杠柳次苷是香加皮中的3个主要强心成分。有文献报道，杠柳毒苷能够调节心血管疾病，具有强心作用[9]，但与此同时，该化合物的含量也与动物死亡率有较强相关性[10]，且其在体内迅速代谢成为杠柳苷元和杠柳次苷[11]，因此对杠柳毒苷、杠柳苷元和杠柳次苷3种化合物的含量测定尤其重要，可为香加皮中毒性成分限量标准考察提供依据。东莨菪内酯是香加皮中的活性成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎等良好的药理作用[12-13]。异香草醛和4-甲氧基水杨醛是香加皮中主要的香气成分，4-甲氧基水杨醛更是《中华人民共和国药典》中唯一的质量控制指标性成分。近年来，对香加皮中化学成分含量测定的方法主要是传统高效液相色谱法，而且测定指标比较单一，主要集中在杠柳毒苷及4-甲氧基水杨醛这个两个化合物[14-15]。目前，UPLC被广泛地应用到中药质量控制的研究中[16-17]。该方法分离效果好、效率高，能快速对目标化合物进行分离分析。本研究采用UPLC同时测定香加皮药材中6种化学成分(杠柳毒苷、杠柳苷元、杠柳次苷、4-甲氧基水杨醛、东莨菪内酯和异香草醛)的含量，并测定不同产地、不同批次的香加皮药材，比较不同批次香加皮样品中6种成分含量差异，拟为香加皮毒性和质量标准的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters ACQUITY超高效液相色谱仪；十万分之一电子天平(AX205瑞士Mettler Toledo公司)；BP121S万分之一天平(德国Sartorius公司)；SB-1000YDTD超声清洗槽(宁波新芝生物科技股份有限公司)；3K15高速离心机(美国Sigma公司)；XW-80A旋涡混合器(上海沪西分析仪器厂)；FW135粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试剂

杠柳毒苷(批号：15072212，纯度99.18%)、杠柳苷元(批号：15072211，纯度99.81%)、杠柳次苷(批号：15080311，纯度99.93%)、东莨菪内酯(批号：14081804，纯度≥98%)，均购自成都曼斯特生物科技有限公司。4-甲氧基水杨醛(批号：20170225，纯度98%)、异香草醛(批号：20170225，纯度98%)，均购自天津万象恒远科技有限公司。乙腈(色谱纯，Merck公司)；甲醇(色谱纯，Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国ACS恩科化学)；超纯水(Millipore公司)。

1.3 药材

香加皮药材购自不同产地。经天津中医药大学常艳旭研究员鉴定为萝藦科植物杠柳PeriplocasepiumBge.的干燥根皮，样品保存于天津中医药大学中医药研究院。香加皮样品粉碎过60目筛，备用。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，)，保护柱：Waters C18柱(12.5 mm×2.1 mm，5 μm)，流动相A：乙腈(含0.05%甲酸)，流动相B：超纯水(含0.05%甲酸)，流速：0.3 mL·min-1，柱温：30 ℃，进样体积：2 μL，检测波长分别为：220、280、340 nm，分析时间：39 min。梯度洗脱程序如下：0～2 min，8%～10%B；2～3 min，10%～10%B；3～4 min，10%～10.5%B；4～5 min，10.5%～12%B；5～9 min，12%～13%B；9～11 min，13%～15%B；11～12 min，15%～19%B；12～14 min，19%～24%B；14～15 min，24%～25%B；15～17 min，25%～25%B；17～20 min，25%～26%B；20～23 min，26%～40%B；23～25 min，40%～47%B；25～27 min，47%～47%B；27～30 min，47%～56%B；30～32 min，56%～78%B；32～34 min，78%～98%B；34～35 min，98%～100%B；35～38 min，100%～100%B；38～39 min，100%～8%B。

1.4.2 样品溶液制备精密称取不同产地、不同批次香加皮粉末0.5 g，用100%甲醇超声提取30 min，静置冷却后用纯甲醇补足体积，14 000 r·min-1离心10 min，两次，取上清液作为样品溶液。

1.4.3 对照品溶液制备分别准确称取一定量异香草醛、4-甲氧基水杨醛、东莨菪内酯、杠柳毒苷、杠柳苷元、杠柳次苷对照品粉末，用纯甲醇溶解配制使其质量浓度均为1.00 mg·mL-1，再依次稀释至适当的浓度，备用。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

UPLC是基于传统高效液相色谱法的理论及原理发展起来的，是分离科学中一项全新的类别，它涵盖细小颗粒的填料、较低系统体积以及有效快速检测等新技术，同时，在灵敏度、色谱峰容量、分析通量方面都有所提高。目前多采用反相色谱法，以非极性的C18键合的硅胶为固定相、色谱柱的粒径可达3.5 μm，甚至1.7 μm，有利于分析物的分离[18]。与传统高效液相色谱法相比，UPLC的分析速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍、1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了有机试剂用量，降低了分析的成本。UPLC多采用水、甲醇、乙腈做为流动相进行洗脱。

本实验根据待测物中化合物不同性质，为达到最佳分离效果，对流动相的组成、柱温、流速等进行了考察和优化。采用乙腈-水梯度洗脱，考察了在超纯水中加入(0.05%、0.1%、0.2%甲酸)和乙腈中加入(0.05%、0.1%、0.2%甲酸)、柱温(30、35、40 ℃)以及流速(0.2、0.3、0.4 mL·min-1)。结果表明，流动相为0.05%甲酸乙腈-0.05%甲酸水、柱温30 ℃和流速0.3 mL·min-1时对香加皮样品进行梯度洗脱，各化合物基线分离较好、灵敏度高、峰形较好，且成本较低。

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线及线性范围本实验采用外标法同时测定香加皮中6个化合物的含量，并对不同产地香加皮药材质量进行检测。将异香草醛(100 μg·mL-1)、东莨菪内酯(100 μg·mL-1)、4-甲氧基水杨醛(400 μg·mL-1)、杠柳毒苷(700 μg·mL-1)、杠柳次苷(200 μg·mL-1)和杠柳苷元(400 μg·mL-1)6个对照品溶液配成混合对照品储备液母液。精密移取一定量各浓度对照品储备液，按不同稀释倍数用纯甲醇稀释成一系列浓度的混合对照品溶液，依次进样测定，以浓度(μg·mL-1)为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线。以信噪比S/N为3∶1作为其检测限(LOD)，S/N为10∶1作为其定量限(LOQ)。各化合物的标准曲线及线性范围见表1，从表1中可知，6个化合物在各自线性范围内r均大于0.999 0，表明6个化合物在其线性范围内线性关系良好。

2.2.2 精密度试验取香加皮中各成分的对照品适量，按一定体积混合配制成混对照品母液，经过一系列逐级稀释，将其稀释成高、中、低3个浓度，在色谱条件下连续进样6次，且连续进样3 d，计算6个化合物峰面积的RSD值，并且根据标准曲线计算6个化合物的浓度值，将测得的浓度值与实际浓度值进行比较，得到各化合物的准确度，考察仪器的日内精密度和日间精密度。结果显示，各化学成分的峰面积RSD均小于5%，表明仪器的精密度良好。见表2。

2.2.3 重复性试验取同一批次香加皮样品(四川1)，按照样品溶液制备方法平行提取6份，在优化的色谱分析条件下连续进样，计算6种化合物峰面积的RSD值。结果各化合物峰面积RSD值均小于5%，表明其重复性良好。

2.2.4 稳定性试验按照样品溶液制备方法制备样品溶液(四川1)，按照优化的色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h内进样同一样品溶液，分别计算6种化合物峰面积的RSD值。结果显示峰面积的RSD值均小于5%，可见样品在24 h内稳定性良好。

2.2.5 加样回收率试验精密称取同一批次(四川1)已知含量的香加皮药材粉末(0.25 g)，平行取样6份，分别加入各对照品溶液适量，按照样品溶液的制备方法处理并测定，按公式(1)计算各个化学成分的平均回收率，结果见表3。

(1)

表1 香加皮中6种化学成分的线性范围、LOD及LOQ

表2 香加皮中6种化学成分的日内精密度、日间精密度(n=3)

表3 香加皮中6种化学成分的加样回收率试验结果(n=3)

2.3 香加皮中6种化学成分含量测定

精密称定20批不同产地、不同批次香加皮药材粉末，按照制备供试品溶液的方法制备，并根据上述的色谱条件进样分析，图1为样品溶液与混合对照品溶液的高效液相色谱图(波长分别为280、220、340 nm)。根据上述标准曲线及线性范围所得的回归方程计算不同批次供试品溶液中6种化学成分的含量，结果见表4。

注：A.香加皮样品280 nm；B.混合对照品280 nm；C.香加皮样品340 nm；D.混合对照品340 nm；E.香加皮样品220 nm；F.混合对照品220 nm；1.异香草醛；2.东莨菪内酯；3.4-甲氧基水杨醛；4.杠柳毒苷；5.杠柳苷元；6.杠柳次苷。图1 香加皮样品与混合对照品的高效液相色谱图

批次化学成分质量分数杠柳毒苷杠柳苷元杠柳次苷异香草醛东莨菪内酯4-甲氧基水杨醛河南A1.19——0.360.093.64河南B2.24—0.060.440.044.02东北12.70—0.220.220.122.44东北20.82——0.210.062.33东北33.730.180.300.150.082.65河北14.980.03—0.340.022.46河北23.81—0.070.290.082.82四川11.960.120.270.380.072.61甘肃16.260.170.300.120.082.58湖北12.66—0.130.330.123.01湖北005.72—0.150.290.112.83湖北772.21—0.190.220.162.02山西A1.09—0.080.360.073.11山西B1.72—0.080.410.134.00山西C0.230.05—0.270.073.67山西3.68——0.300.102.77山西25.68—0.070.700.073.70山西554.80—0.050.230.062.32内蒙古11.46——0.340.072.93河南12.580.030.170.210.091.39

注：—表示该化合物含量低于定量限。

从上述不同产地、不同批次香加皮样品中6种成分含量测定结果可知，不同产地、不同批次香加皮药材含量存在差异，其中杠柳毒苷成分含量差异最大，且《中华人民共和国药典》没有对其毒性成分限量标准规定，给大众用药带来一定的安全隐患。《中华人民共和国药典》规定，本品按照干燥品计算，含4-甲氧基水杨醛(C8H8O3)不得少于0.20%，除河南1产地外，剩余19批香加皮药材均符合《中华人民共和国药典》规定(4-甲氧基水杨醛含量均在2.02～4.02 mg·g-1)。因此，采用本实验超高效液相色谱法可以对香加皮中多种化学成分进行质量控制研究，需要结合毒性实验对其毒性成分进行限量考察，建立符合安全用药原则中药香加皮毒性成分限量方法。