烟草过氧化物酶基因NtPOD2 的克隆及表达分析

王静 刘仑 杨勇 胡圣 李立芹

（1. 四川农业大学作物科学国家级实验教学示范中心，成都 611130；2. 四川农业大学农学院，成都 611130）

植物在非生物胁迫和生物胁迫下会导致细胞活性氧（Reactive oxygen species，ROS）过量的积累，过量的ROS 积累会非特异性的损害细胞组分，包括细胞核、核酸、蛋白质以及光合色素等，在生物体内抗氧化酶可以清除活性氧，维持细胞内ROS 平衡，在抗氧化物酶中POD 起着关键的作用［1］。在植物中广泛存在过氧化物酶，且具有多种功能［2］。过氧化物酶是多基因家族酶类，参与植物多种代谢途径，如植物的抗旱、抗盐、抗寒等多种抗逆功能［3-5］。烟草是中国非常重要的经济作物，烟草的产量与品质受到盐碱、冷害以及干旱等非生物胁迫的影响，因此在分子水平上研究POD 对提高烟草非生物胁迫耐逆性具有重要意义。

POD 是广泛存在于植物中的氧化还原酶，在植物生长发育和应激反应中发挥着重要的作用，是植物重要的保护酶类，最常见的是第Ⅲ类分泌过氧化物酶（Secretory peroxidase，POD），其功能是催化去除H2O2，参与木质部合成和降解、还原剂氧化和植物形态的形成，并参与环境胁迫相应［6-9］。目前，研究表明，POD 家族基因与植物生长发育有关，如植物木质素聚合、栓化作用、细胞壁结构蛋白的交联等［10-11］。在许多植物中POD 的作用都有过报道，而最主要的作用是利用H2O2为底物来参加各种还原物质的氧化。ROS 是植物在胁迫刺激下产生的，并被POD 还原为H2O 和O2，因此POD 是植物非生物胁迫下清除ROS 的关键酶。Sierla 等［12］研究表明，在植物胁迫下，POD 活性增加，且参与了胁迫途径调控。Kumar 等［13］和Neill 等［14］研究表明，植物中的ROS 可以被POD 部分清除。目前，植物中POD 基因研究取得了很大进展，在山楂、水稻、小麦等多种植物中成功克隆POD 家族基因［15-17］。但植物中POD 与ROS 具体作用机制仍不明确。

本研究成功克隆到过氧化物酶家族基因NtPOD2，预测NtPOD2编码蛋白结构与功能，同时运用荧光定量测定NtPOD2在烟草各个组织中表达水平，以及在非生物胁迫处理下的表达模式，为进一步研究POD 基因在烟草中与ROS 作用机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

挑选饱满均一的普通烟草（K326）种子，消毒（75%乙醇和20%NaClO），反复用无菌水清洗，播种于MS 培养基培养2 周，取大小均匀的幼苗进行ABA、H2O2、干旱、低温、低钾及高盐胁迫处理，每项处理设置3 次重复，分别在0、3、6、12 和24 h 共5 个时间点整株取样。ABA 与H2O2非生物胁迫具体处理方法参照张雪薇等［18］。

1.2 方法

1.2.1NtPOD2的 克 隆 用Primer 5.0 软 件 设 计NtPOD2引 物NtPOD2-F 和NtPOD2-R（ 表1）。 以烟草叶片为材料，提取RNA，按照反转录试剂盒步骤进行反转录合成cDNA，将cDNA 稀释10 倍进行PCR 扩增，PCR 反应程序为95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min，35 个循环。1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段，将其与pMD19-T载体连接，转化，在含有Kn 的LB 固体培养基进行涂板，过夜培养后，挑取3 个单克隆菌落进行测序。

表1 引物序列

1.2.2 生物信息学分析 参照王静等［19］方法进行NtPOD2的生物信息学分析。

1.2.3 烟草NtPOD2的表达分析 采用Primer 5.0 设计荧光定量引物，烟草18SrRNA为内参，引物序列为18S-F 和18S-R（表1）。每个样品重复4 次，结果分析参考王静等［19］方法。

1.2.4 构建过表达载体 重组克隆载体NtPOD2-pMD19-T 与表达载体pBI121 酶切反应，NtPOD2-pMD19-T 进行37℃双酶切，酶切体系为10×T Buffer、1 μL；XbaⅠ 0.5 μL、SmaⅠ 0.5 μL、载 体3 μL 和ddH2O 5 μL。酶切过后产物与pBI121 载体16℃连接过夜，连接后产物转化DH5α 大肠杆菌感受态，在涂有Kn 的LB 培养基平板式上筛选，挑取单克隆菌株摇菌并送去测序公司进行测序，检测是否构建成功。

2 结果

2.1 NtPOD2的克隆

以烟草叶片cDNA 为模板进行PCR 扩增，获得一条大小为750-1 000 bp 条带。经回收和测序，片段大小为897 bp（图1）。

2.2 NtPOD2-pBI121过表达载体的构建

通过对NtPOD2-pMD19-T 质粒进行双酶切和测序，结果一致，目的片段大小为897 bp（图2）。

2.3 NtPOD2蛋白序列生物学分析

图1 NtPOD2 的克隆

图2 NtPOD2-pBI121 重组质粒酶切

对NtPOD2 蛋白进行生物学分析，理化性质分析结果表明，NtPOD2 蛋白分子量为32.55 kD，等电点为5.78，不稳定系数为37.72。疏水性分析结果显示该蛋白属于亲水性蛋白（图3）。NCBI 在线分析NtPOD2 蛋白保守功能域（图4），该蛋白属于Class Ⅲ型分泌性过氧化物酶。采用SMART 和Scan Prosite 分析NtPOD2 蛋白理化性质，结果为NtPOD2 蛋白含有6 个蛋白激酶C 磷酸化位点（67-69 SeK；70-72 TaR；77-79 SaR；183-185 TfR；200-202 SqR；235-237 SkK）、1 个N-糖基化位点（75-78 NNSA）、5 个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点（89-92 SevD；101-104 ScaD；183-186 TfrD；192-195 TniD；209-212 SggD）、1 个氨基化位点（126-129 lGRR）、1 个依赖于cAMP 和cGMP 的蛋白激酶磷酸化位点（128-131 RRdS）。NtPOD2 蛋白信号肽预测结果显示，NtPOD2 蛋白不存在信号肽，定位在细胞质中的概率最大（0.65）。二级结构分析表明，NtPOD 蛋白二级结构的最大元件为α-螺旋，最小元件为β-转角（图5-A）。三级结构分析结果表明，6个半胱氨酸残基48-53、102-294 和181-206 分别形成3 个保守的二硫键桥（图5-B）。

图3 疏水性分析

图4 保守结构域分析

图5 NtPOD2 编码蛋白的结构预测

2.4 NtPOD2同源性分析

把NtPOD2编码氨基酸序列与绒毛状烟草、美花烟草、番茄、马铃薯以及胡杨POD2通过Dnaman多重序列比对（图6-A），发现NtPOD2 蛋白具有POD 家族典型的结构特征，在N 端都包含peroxidase活性位点GAslLRLhFHDC。把NtPOD2编码氨基酸序列通过Blast 比对，选择不同物种POD2 氨基酸序列下载，通过MEGA5 构建系统进化树（图6-B），结果表明，NtPOD2 蛋白序列与绒毛状烟草POD2 以及美花叶烟草POD2 蛋白序列有较高同源性，分别为99%和94.65%。

2.5 NtPOD2的组织表达分析

采用qRT-PCR 对烟草K326 各个组织进行表达分析，发现NtPOD2在根、茎、叶、花中均有表达，在根中表达量明显高于茎、叶、花（图7-A）。

2.6 NtPOD2在信号分子处理下的表达分析

烟草K326 幼苗上在培养皿上用ABA 和H2O2处理，对处理后烟草幼苗NtPOD2表达分析表明，在12 h 之前，ABA 处理下NtPOD2的表达受到抑制，24 h 时受到显著诱导，为对照的3.14 倍（图7-B）；H2O2处理的早期，NtPOD2的表达受到强烈诱导，12 h 时上升至最大，为对照的120.67 倍（图7-C）。以上结果表明NtPOD2能够响应逆境胁迫相关的信号分子调控。

图6 NtPOD2 同源性分析

2.7 NtPOD2在逆境胁迫下表达分析

PEG 和低温处理后，该基因分别在12 h 和6 h 时达到最大值，分别为对照的2.48 倍（图8-A）、8.60 倍（图8-B）。低钾处理下，NtPOD2表达量上升，NaCl 处理下该基因下调（图8-C-D）。结果表明，NtPOD2可能参与了PEG、低温等非生物胁迫。

3 讨论

生物信息学分析表明，NtPOD2 蛋白含有3 个二硫键，属于分泌蛋白，含有活性位点（GAslLRLhFHDC），属于典型的Class Ⅲ型分泌性过氧化物酶。信号肽预测显示NtPOD2 蛋白定位在细胞质中，因此该基因可能在内质网加工成熟，进而通过高尔基体运输到细胞质。该蛋白与其他物种Class Ⅲ型分泌性过氧化物酶相比含有相似的保守结构域（6A）以及二硫键桥［20］。该蛋白含有最大元件为α-螺旋，最小元件为β-转角。NtPOD2蛋白以Asp47、Val50、Gly52、Asp54 和Ser56 为中心的Ca2+结合位点构成远端的氧供体结构域，而Thr175、Asp219、Thr221 和Asp226 为 中 心 的Ca2+结合位点构成近端的氧供体结构域，位于这两个结构域中间的血红素则由Fe2+与His46 和His174 形成共价键，构成活性中心。蛋白质空间结构影响其功能，NtPOD2 蛋白特定的空间结构为其发挥功能奠定了基础。同源性分析表明，NtPOD2 蛋白与其他植物POD 蛋白含有较高同源性，其中与美花烟草POD2同源性为99%，可能与美花烟草POD2是POD 家族的同一成员。通过对NtPOD2生物学分析，旨在为研究POD 基因家族奠定基础。

图7 NtPOD2 的不同组织及信号分子处理下的表达模式

图8 NtPOD2 在非生物逆境胁迫下的表达模式

烟草Ntpx在花中表达量最高，银杏GbPOD1和小桐子JcPOD73茎中表达量最高［21-22］。郭媖等［23］从陆地棉中克隆的GhPOD1和GhPOD2，两者相似性达99%，但表达模式相差很大。作为多基因家族的POD基因，具有功能多样性的特点。本研究表明NtPOD2在组织中都有表达，但根中表达最高，而茎、叶、花表达量相对较少，不同植物中POD 基因在不同部位表达模式不同，说明POD 家族基因表达存在特异性。NtPOD2在ABA 处理下，表达量在3 h 先下降，20 h 又上升至最大，约为对照的3.14 倍（图5-B），说明NtPOD2受ABA 诱导。Gao 等［1］研究表明柽柳ThPODs参与非生物胁迫反应（PEG、ABA、NaCl 等），并依赖ABA 信号转导途径。钟新榕等［24］用不同浓度的ABA 处理黄瓜幼苗，POD 活性在短时间内可以提高。Anderberg 等［25］研究结果表明低温胁迫、盐胁迫以及干旱胁迫下，能较短时间内增加植物体内ABA 含量，进而诱导ABA 调控相关基因的表达。司丛丛等［26］研究表明，烟草Ntpx在5%PEG6000胁迫下，Ntpx在最初无明显变化，在6 h 后表达量上调在ABA 和干旱胁迫下，表达量上调。本研究采用10 mmol/L H2O2处理烟草幼苗，NtPOD2的表达受到强烈诱导，12 h 时上升至最大，为对照的120.67 倍。苏亚春等［27］用100 μmol/L ABA 处理甘蔗，结果表明，ScPOD02表达量在3 h 显著增加，500 mmol/L H2O2处理下随着时间的延长，ScPOD02表达量基本不变。而这与苏亚春等在ABA、H2O2处理甘蔗后，ScPOD02表达模式不同，这可能是不同的浓度ABA、H2O2造成的。由此说明NtPOD2可能受干旱、ABA、NaCl、H2O2胁迫诱导，并依赖ABA 信号转导途径进而参加植物生长发育。

在200 mmol/L NaCl 处理下NtPOD2表达量呈现先下降后上升又下降的表达模式，在12 h 表达量达到最大，约为对照1.12 倍。苏亚春等［27］用250 mmol/L 的NaCL 处理下ScPOD02表达量先在6 h 下降，而在12 h 表达量又上升，约为对照的1.91 倍。与苏亚春用NaCl 处理甘蔗后ScPOD02表达模式一致，在6 h 前表达量下降，在12 h 时表达量上升为最大，之后又下降。程华等［21］用200 mmol/L NaCl喷洒银杏幼苗后，POD1表达量降低。Bae 等［11］用200 mmol/L NaCl 处理白杨后PoPOD1基因表达水平下调。低钾胁迫下，NtPOD2受到强烈诱导，NtPOD2表达量上调。王伟等［28］研究表明，大豆在低钾胁迫下，细胞内氧负离子O2-增加，超氧化物歧化酶催化O2-发生歧化反应生成H2O2-含量增加，进而引起过氧化物酶活性上升。在低温胁迫下，NtPOD2在6 h 表达量达到最大，在12 h 后又降低。Guo 等［29］在4℃条件下处理柽柳叶和根，叶中ThPOD1表达量在6 h 强烈诱导后又逐渐下降，根ThPOD16 h 强烈诱导后在24 h 达最大值后又下降。外源基因的表达增加宿主细胞的耐受性，植物受到生物胁迫以及非生物胁迫下，可以引起活性氧产生，进而破坏细胞稳态以及防御机制［30-31］。由此说明烟草NtPOD2，在不同胁迫下表达模式发生改变，以上均说明该基因在生物胁迫以及非生物胁迫中发挥着重要作用，由此推测，NtPOD2参与生物胁迫与非生物胁迫，可能引起活性氧的改变，进而参与植物生理调控与防御机制。

4 结论

NtPOD2可能通过ABA 信号通路来参与生物胁迫以及非生物胁迫。