辛伐他汀联合利塞膦酸钠对尾悬吊诱导小鼠骨丢失的作用

范新昊，田发明，王婧瑶，张 楠，迟博婧，张国彬*，郭志斌

(1.开滦总医院，河北 唐山 063000；2.华北理工大学，河北 唐山 063000；3.开滦总医院林西矿医院，河北 唐山 063000)

一定的负荷刺激对于维持骨稳态和骨骼健康至关重要，适当应力刺激如体育锻炼可促进骨形成[1]，而失用造成的负荷刺激缺失往往会造成肌肉萎缩和骨量丢失，研究表明，长期卧床、瘫痪或航天飞行导致每月1%～2%的骨量丢失[2]。目前对于该类骨丢失的治疗仍以二磷酸盐类药物为主，可以通过抑制骨吸收降低骨转换率部分抑制宇航员骨量下降，但该类药物对促进骨形成的作用有限[3]。如果在干预方案中考虑抑制骨吸收与促进骨形成药物联合应用，可能疗效会优于单纯抑制骨吸收，也更适用于防治失用导致的骨丢失。

辛伐他汀是目前一线降血脂药物，其成骨作用潜能近年来备受关注。课题组前期研究证实辛伐他汀单纯体内干预虽表现出一定的骨保护作用[4]，但仅对大鼠股骨近端的骨丢失有抑制作用，如果联合应用骨吸收抑制剂如利塞膦酸钠，能否取得更好效果，尚有待进一步研究证实。基于以往研究，不同性质的骨代谢调节剂联合应用有可能取得更好的抗骨质疏松的作用[5]，我们推测辛伐他汀与利塞膦酸钠联合应用可以抑制失用性骨丢失，并较单独用药具有更好的效果。本研究 拟通过尾悬吊法建立小鼠失用性骨丢失模型，并给予辛伐他汀和或利塞膦酸钠干预，观察单独用药与联合用药的干预效果，以期为进一步探索相关干预方案和作用机制等后续研究乃至相关临床干预提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本研究应用SPF级12周龄雄性C57BL/6小鼠30只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK (京)2017-0001]，体重(25±3)g，所有小鼠在华北理工大学动物中心屏障环境中饲养[SYXK (冀)2015-0038]。本研究中涉及实验动物的处理和干预，均符合华北理工大学实验动物伦理委员会的相关规定，动物实验伦理审查证明编号为：LX201809，并遵照实验动物使用的3R(减少、替代、优化)原则给予人道关怀。制备模型与处死时应用小动物多功能麻醉机进行诱导麻醉，麻醉药物为异氟烷，气体流量500 mL/min，浓度1.5%，处死时与其他动物隔离。

1.2 主要试剂与仪器

异氟烷(深圳市锐沃德生命科技有限公司)；利塞膦酸钠(北京双鹭药业股份有限公司)；辛伐他汀(浙江瑞邦药业有限公司生产)；TRIzol(Invitrogen，美国)；TaKaRa逆转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒(大连宝生物有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(南京建成生物技术有限公司)；小鼠OPG(美国Abcam公司)、RANKL抗体(美国Santa Cruz公司)、山羊抗兔二抗(美国SAB公司)。微计算机断层扫描(micro-CT，Skyscan，比利时)；AG-IS型万能试验机统(日本岛津公司)；PCR仪(Applied biosystems美国)；小动物多功能麻醉机(ZS-MV-I，北京众实迪创科技发展有限责任公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及处理

所有小鼠随机分成5组，每组6只：对照组(A组)、模型组(B组)、辛伐他汀组(C组)、利塞膦酸钠组(D组)和联合干预组(E组)。除A组外，其余各组小鼠均采用尾部悬吊(躯体与地面呈40°左右角度，以后肢伸直不能着地为准)制备尾悬吊拟失重模型，分别给予生理盐水(B组)，辛伐他汀(5 mg/(kg·d)，C组)、利塞膦酸钠(1 mg/(kg·d)，D组)和两者联合(E组)灌胃干预，3周后异氟烷麻醉处死取材。实验结束时各组均无小鼠死亡，所有动物纳入最终指标分析和结果统计。

1.3.2 Micro-CT分析

应用Sky Scan 1076 Micro-CT 对小鼠左侧胫骨进行扫描检测，收集数据，并利用Micro-CT 配套软件对扫描图像进行三维重建及结果分析。胫骨近端松质骨兴趣区为上端生长板下0.5～2 mm，皮质骨内侧的松质骨；胫骨中段皮质骨感兴趣区为胫腓骨连接处上方1 mm。松质骨检测指标有: 骨容积率(bone volume fraction，BV/TV)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)、结构模型指数(Structure Model Index, SMI)。皮质骨检测指标BV /TV、皮质骨厚度(Cortical bone thickness，Ct.Th)。

1.3.3 生物力学检测

取所有小鼠的右侧股骨行生物力学分析，采用三点弯曲试验，支点跨距(L)为6 mm，中央垂直(股骨与载荷成90°角)加载负荷，速率5 mm/min，直至股骨断裂，记录并分析最大压缩载荷及弹性模量。

1.3.4 聚合酶链反应

实验结束后提取小鼠右侧胫骨，制备组织匀浆，采用TRIzol法提取总RNA，应用TaKaRa试剂盒进行逆转录合成cDNA，实时荧光光定量聚合酶链反应(PCR)检测OPG和RANKL的表达。配制反应液：10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，0.8 μL Forward Primer，0.8 μL Reverse Primer，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，2 μL cDNA，6 μL灭菌水，总体系为20 μL；Real-time PCR反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 34 s，共40个循环；记录各标本扩增的Ct值，以2-ΔΔCt作为统计数值，检测各基因与内参基因GAPDH的比值，得出目的基因表达的相对含量，公式如下：ΔΔCt=Ct处理组(目的基因-内参基因)-Ct对照组(目的基因-内参基因)。引物序列OPG 上游5’-TTTCTTCTGGGCTGATCTTCTTCC-3’，下游5’-CATCCAAGACATTGACCTCTCTTGA-3’；RANKL 上游5’-CTGATGAAAGGAGGGAGCACG-3’，下游 5’-GGAAGGGTTGGACACCTGAATG-3’；GAPDH 上游5’-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3’，下游5’-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGTT-3’。

1.3.5 Western blot

实验结束后，提取各组小鼠右侧股骨总蛋白，采用BCA定量蛋白，根据测定蛋白浓度计算上样量，经电泳及转膜后，取出PVDF膜置于TBST配制的5%脱脂奶粉中孵育、漂洗2 h，完成对非特异性抗原的封闭。封闭结束后将膜与OPG抗体(1∶200)或RANKL(1∶200)抗体孵育，4℃过夜。次日加入IgG二抗稀释液(1∶1000)中，37℃摇床孵育2 h，然后置于TBST缓冲液摇床漂洗，控干TBST后，用ECL显色液显色，待蛋白条带清晰后立刻取出PVDF膜，置于清水中终止显色。采用Image J软件进行图像灰度扫描测定，测定目的蛋白OPG、RANKL与内参蛋白β-actin的OD值，计算两者比值作为其相对表达量，进行统计分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 Micro-CT检测结果

各组小鼠胫骨中段皮质骨及胫骨近端松质骨的micro-CT三位重建图如图1所示。相关参数的数据分析结果如下：皮质骨：骨容积率比较，B、C、D、E组均显著低于A组(P<0.05)；E组显著高于B、C、D组(P<0.05)，其余组间比较无显著差别(P>0.05)。皮质骨厚度，B、C组显著低于A组(P<0.05)，E组显著高于B、C组(P<0.05)，其余组间比较没有显著差异(P>0.05)。见表1。

胫骨近端松质骨分析结果：骨容积率：B、C、D、E组显著低于A组(P<0.05)；C、D组显著高于B组(P<0.05)，E组显著高于B、C、D组(P<0.05)；骨小梁数量：B、C、D组显著低于A、E组(P<0.05)；骨小梁厚度：B组显著低于A组(P<0.05)，C、D、E组显著高于B组(P<0.05)；骨小梁分离度B、C、D组显著高于A、E组(P<0.05)；结构模型指数B、C、D、E组显著低于A组(P<0.05)。见表2。

2.2 生物力学

最大载荷：B、C、D、E组显著低于A组(P<0.05)，E组显著高于B组(P<0.05)，其余各组间两两比较无显著差别(P<0.05)；弹性模量：B、C、D组显著低于A组(P<0.05)，B、E组显著高于B组(P<0.05)，其余各组间两两比较无显著差别(P<0.05)。见表3。

图1 小鼠胫骨micro-CT三维重建图

Table1Results of micro-CT of cortical bone in the middle shaft of the tibia

指标Indices对照组(A组)Control group(group A)模型组(B组)Tail suspension group(group B)辛伐他汀组(C组)Simvastatin treatmentgroup (group C)利塞膦酸钠组(D组)Risedronate sodiumtreatment group (group D)联合治疗组(E组)combined treatmentgroup (group E)骨容积率(%)BV/TV0.69±0.020.61±0.02a0.63±0.03a0.63±0.02a0.66±0.03abcd皮质骨厚度(μm)Ct.Th230.3±11213.7±10.5a214.8±8.5a225.1±14.8231±13.1bc

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05；与D组比较，dP<0.05。

Note.Compared with the group A,aP<0.05.Compared with the group B,bP<0.05.Compared with the group C,cP<0.05.Compared with the group D,dP<0.05.

表2 胫骨近端松质骨micro-CT分析结果

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05；与D组比较，dP<0.05。

Note.Compared with the group A,aP<0.05.Compared with the group B,bP<0.05.Compared with the group C,cP<0.05.Compared with the group D,dP<0.05.

2.3 PCR检测结果

实时荧光定量PCR分析结果显示，OPG的mRNA表达在C、E组显著高于B组(P<0.05)，其余组间比较未见显著差异(P<0.05)；RNAKL在B组表达显著高于A组(P<0.05)，其余组间比较未见显著差异(P<0.05)。见表4。

2.4 Western blot检测结果

Western blot分析OPG、RANKL蛋白表达结果显示：OPG在A组的表达显著高于其余各组(P<0.05)，E组显著高于B组(P<0.05)；RANKL在A组的表达显著低于其余各组(P<0.05)。如图2所示。

3 讨论

失用性骨质疏松在临床中多见于长期卧床的患者，骨量丢失、肌肉力量减弱和协调性下降会增加骨折风险。而一旦发生骨折，往往对患者乃至其家庭带来沉重打击，目前对于失用性骨质疏松的重视程度仍亟待提高，其有效防治方案也在积极探索中。通过对小鼠尾部悬吊离地，导致后肢应力缺失是目前常用的模拟失用性骨质疏松的动物模型[6-7]。本研究经过三周尾悬吊成功制备了该小鼠模型，Micro-CT分析发现该模型小鼠骨量下降，微结构退变，蛋白水平RANKL表达水平上调，OPG水平下调，提示该模型同时伴有骨形成下降和骨吸收活性增强，这也与部分研究结果一致[8-9]，由于失重导致的骨细胞凋亡分泌更多的RANKL是该模型骨吸收活跃并导致骨丢失的重要机制[9]。

表3 生物力学检测结果

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05。

Note.Compared with the group A,aP<0.05.Compared with the group B,bP<0.05.

表4 PCR检测结果

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05。

Note.Compared with the group A,aP<0.05.Compared with the group B,bP<0.05.

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05。

他汀类药物，尤其是水溶性他汀类药物，除了降脂外，其他潜在作用也日益收到关注，其促进骨形成潜能目前已初步得到认可[10-12]，课题组在前期研究中发现辛伐他汀可部分阻止尾悬吊大鼠股骨近端骨丢失，但未能达到正常对照组水平，本研究中我们发现，辛伐他汀作用3周可部分组织小鼠胫骨近端松质骨的骨丢失，但对胫骨中段皮质骨丢失的抑制作用并不显著。但是mRNA水平对OPG和RANKL的分析发现，辛伐他汀可有效促进OPG在mRNA水平的表达，但进一步分析发现对蛋白水平的表达影响并不显著。鉴于蛋白水平不仅仅取决于生产效率及mRNA翻译过程，也同样收到降解相关因素的影响，因此虽然我们在该单一节点提取的蛋白表达水平为观测到显著差异，但mRNA表达水平的升高也初步提示了辛伐他汀的促进骨形成作用。辛伐他汀对OPGmRNA表达的促进作用和对RANKLmRNA抑制作用在以往研究中均有报道[13-14]。

利塞膦酸钠作为第三代二磷酸盐类药物[15-17]，是目前一线应用的抗股指数松药物之一，但主要应用于绝经后骨质疏松症，对于失用性骨质疏松的干预效果报道较少。本研究发现，利塞膦酸钠可以部分阻止该模型松质骨和皮质骨骨量丢失，较之辛伐他汀，对于维持皮质骨厚度的作用更为显著。但生物力学进一步分析发现，两者单独干预均未能表现出显著效果，利塞膦酸钠对该模型小鼠组织学水平的影响并无显著优势。有研究比较了联合阿仑膦酸盐和辛伐他汀或单独用药对高脂饮食卵巢切除大鼠的抗骨质疏松和抗动脉粥样硬化作用，结果发现阿仑膦酸钠和辛伐他汀联合应用具有抗骨质疏松、抗血脂异常和抗动脉粥样硬化的作用[18]。本研究中，与单独用药相比，多项检测均支持两者联合应用效果更好，部分指标包括微观结构参数和弹性模量等与正常对照组无显著差别，且均优于单独用药组，OPG和RANKL蛋白水平的分析亦发现，联合用药促进OPG表达的作用更显著。在一项糖皮质激素诱发的大鼠骨质疏松模型的研究中中，虽然利塞膦酸钠表现出一定的保护骨质量的作用，但合并辛伐他汀干预较单纯利塞膦酸钠表现出更好的效果[19]。

然而，不同性质药物合并使用并非能取得叠加或协同效应，比如与单独使用利塞膦酸钠相比，维生素K2与利塞膦酸钠合并使用并不能显著降低骨质疏松患者骨折发生风险[20]。因此，本研究采用的干预方案对该类骨质疏松的干预效果尚有待更多的研究证实和探讨。此外，本研究存在一定的局限性。首先，两种药物选择单一剂量，并未探讨不同剂量配比的作用效果，不排除更佳药物剂量的联合应用方案。此外，本研究并未探讨联合用药方案对不同月龄大鼠模型的干预效果，且尾悬吊法不能完全模拟人类失用性骨质疏松。因此，干预方案的单一和动物模型的选择是本研究的主要局限，后续仍需更多研究深入探讨。