人参皂苷Rg3通过TGF-β1/ERK信号通路调控原位荷瘤人肺癌裸鼠的淋巴管生成的机制

2019-12-04汪国文李其才黎传奎

中国比较医学杂志 2019年11期

陶涛，汪国文，李其才，黎传奎

(蚌埠医学院第一附属医院，安徽蚌埠 233004)

人参在我国具有悠久的使用历史，在抗肿瘤中也具有一定的功效，人参皂苷Rg3(GS-Rg3)是一种从中药人参中提取的固醇类中药单体，具有多种生物学活性，包括对于肿瘤，GS-Rg3具有抑制其增殖、促进细胞凋亡的作用，但是关于其具体机制尚不明确[1]。最近有研究显示GS-Rg3也具有抑制淋巴管生成的作用，肿瘤细胞通过淋巴管进入淋巴结是肺癌淋巴转移的主要方式之一，有研究发现转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)在肿瘤中过表达，发挥促增殖的作用，TGF-β1/ERK可以促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达从而促进管生成[2-3]。SCH772984是一种新型特异性的ERK抑制剂，广泛应用于ERK相关信号通路的研究。因此本文主要分析人参皂苷GS-Rg3对荷瘤人肺癌裸鼠淋巴管生成的机制，并研究其对肿瘤组织TGF-β1/ERK通路以及VEGF表达的影响，分析GS-Rg3的作用机制，为GS-Rg3在临床治疗肺癌提供理论依据和新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

4～5周龄(体重14 g～17 g)的SPF级BALB/c无胸腺雄性裸鼠60只，均购自华东师范大学科学实验动物中心闵行校区[SCXK (沪)2016-0004]，饲养于华东师范大学科学实验动物中心闵行校区[SYXK (沪)2015-0011]的独立通风笼盒中。

1.1.2 细胞系

人肺癌A549细胞购自ATCC(美国)。

1.2 主要试剂与仪器

RPM1-1640培养基以及胎牛血清等培养试剂购自Gibco(美国)；戊巴比妥购自Sigma公司(美国)；GS-Rg3购自齐一生物科技公司(中国，上海)；ERK抑制剂SCH772984购自Sellect公司；HE染色试剂盒购自武汉华美公司(中国)；逆转录试剂盒和SYBR Prellix Ex TaqTM实时PCR试剂盒购自TaKaRa(日本)；抗体TGF-β1、ERK、p-ERK、podoplanin、VEGF-C、VEGF-3以及相关二抗均来自Abcam公司(美国)；PVDF膜(Bio-Rad，美国)；PCR引物由Genewiz(中国)设计和合成。显微镜Nikon(日本)。

1.3 实验方法

1.3.1 荷瘤裸鼠分组、建模及干预方法

将60只小鼠随机分为3组，各20只，即模型组、GS-Rg3组和ERK抑制剂SCH772984组(以下简写为SCH772984组)。根据文献[4]建立人肺癌裸鼠原位移植模型，将生长良好的A549细胞分裂并在新鲜培养基中再生长一天，皮下注射全部小鼠，注射细胞数为5×106个，待瘤体生长至10 mm使剥离瘤体移植至模型组、GS-Rg3组和SCH772984组的小鼠肺组织。GS-Rg3组小鼠在移植后第3天使用GS-Rg3灌胃，每只0.8 mg/kg，SCH772984组小鼠移植后第3天腹腔注射SCH772984，每只12.5 mg/kg，每3 d一次，饲养28 d后处死小鼠进行检验。实验过程遵循3R原则，并通过蚌埠医学院第一附属医院实验动物使用与管理委员会批准(H 2017123546)。

1.3.2 肿瘤生长情况以及病理学检查

戊巴比妥腹腔注射(60 mg/kg)麻醉后处死大鼠，打开胸腔，观察肺癌生长和转移情况，并取出肺组织，测量肿瘤体积，使用HE染色检测肺组部组织学变化，按照试剂盒说明书操作。

1.3.3 免疫组化染色

肺癌原位移植瘤组织用甲醛和石蜡固定，将切片(4.0 μm)脱石蜡并再水合，抑制内源性过氧化物酶活性，首先封闭切片并在4℃下用VEGF-C、VEGF-3或podoplanin抗体孵育过夜，然后在室温下与生物素化的抗小鼠IgG孵育30 min，随后染色，显微镜观察，根据文献报道的方法[5]计算淋巴管密度。

1.3.4 qPCR

qPCR用于检测肺癌原位移植瘤组织中mRNA水平，组织裂解后收集总mRNA，通过95℃激活DNA聚合酶5 min进行PCR，然后进行40个循环的两步PCR(95℃，10 s和60℃，30 s)，最终75℃延伸10 min，保持在4℃，GAPDH作为内参，使用2-ΔΔCT法分析mRNA水平。

1.3.5 Western blot

使用Western blot检测肺癌原位移植瘤组织中蛋白水平。在液氮的保护下裂解组织，在12 000 r/min，4℃离心15 min收集上清液，使用BCA方法确定蛋白质浓度。使用10%的SDS-PAGE凝胶用于电泳，电泳后使用PVDF膜转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2 h。加入一抗室温震荡2 h，后在4℃孵育过夜，加入二抗。使用GAPDH作为内参。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 建模及干预情况

模型组和各干预组小鼠肺癌模型均建立成功，并通过HE染色病理检查证实肺癌以及肺癌淋巴转移，见图1。干预后21 d模型组小鼠死亡1只，其余小鼠无死亡。GS-Rg3组和SCH772984组小鼠出现淋巴转移的比例、肿瘤体积和肿瘤质量均显著低于模型组，GS-Rg3组和SCH772984组无显著差异，见表1。

2.2 各组淋巴微管着色情况比较

本次研究使用podoplanin蛋白标记淋巴管，图2中褐色为podoplanin染色，可用于反映淋巴管生长情况。结果显示GS-Rg3组和SCH772984组podoplanin蛋白表达水平和淋巴管相对密度显著低于模型组，而GS-Rg3组和SCH772984组无显著差异，其免疫组化染色结果见图2、表2。

注：箭头指示淋巴转移。标尺=100 μm。

Table1Comparison of lymphatic metastases and lung tumor volumes of the mice in each group

组别Groupsn淋巴转移个数及百分比Number and percentage of lymphatic metastases肿瘤体积(mm3)Tumor volume肿瘤质量(g)Tumor mass模型组Model group1915(78.95%)583.43±18.540.72±0.21GS-Rg3组GS-Rg3 group207(35.00%)∗∗302.93±17.51∗∗0.29±0.17∗∗SCH772984组SCH772984 group205(25.00%)∗∗231.45±14.25∗∗0.21±0.14∗∗

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note.Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

表2 各组小鼠podoplanin蛋白表达水平

注：与模型组比较，*P<0.05。

Note.Compared with the model group,*P<0.05.

2.3 各组TGF-β1/ERK通路表达水平比较

GS-Rg3组和SCH772984组可以显著抑制TGF-β1和ERK mRNA的表达，并且GS-Rg3组和SCH772984组的p-ERK/ERK水平显著低于模型组，而GS-Rg3组和SCH772984组无显著差异，说明GS-Rg3可抑制TGF-β1/ERK通路的激活，见表3和图3。

2.4 各组肿瘤组织中VEGF-C、VEGF-3表达水平比较

免疫组化检测结果显示GS-Rg3和SCH772984的VEGF-C、VEGF-3表达水平较模型组低，而GS-Rg3组和SCH772984组无显著差异，见图4、图5和表4。

表3 各组小鼠TGF-β1、ERK mRNA和蛋白表达水平比较

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note.Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

图3 Western blot检测各组小鼠中TGF-β1、p-ERK和ERK蛋白水平

3 讨论

肺癌的发病率及病死率均高居首位，调查显示2015年我国肺癌新发病例数达到73.3万，死亡病例高达61万，并且其发病率和死亡率仍呈现上升趋势[6]。虽然随着新的激酶抑制剂药物、放疗新方法被不断应用于临床，肺癌患者的短期疗效有了显著的提升，但是肺癌的复发率和转移情况仍未得到显著的改善，并且对于化疗药物的耐药问题仍未得到有效的解决[6]。

中药在治疗肿瘤中取得了一定的进展，可能成为治疗肺癌的新方法。人参在中国具有悠久的使用历史，已经有研究发现人参也具有较好的抗肿瘤作用，人参可以抑制胃癌细胞的生长并促进其凋亡[7]。分析人参中的抗肿瘤活性成分并探究其抗肿瘤机制是研究的热点，也是将中药在临床上大范围推广的重要手段，GS-Rg3是人参的主要活性成分之一，可以抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，从而抑制肿瘤生长和转移，但是关于其对肺癌作用的相关机制的研究还不足[8-9]。血管以及淋巴管的形成是肿瘤向远端转移的主要途径，目前关于GS-Rg3在肿瘤管生成中的研究不多，最近的也有研究显示GS-Rg3也具有抑制血管生成的作用[10]，关于GS-Rg3对肿瘤淋巴管形成的影响研究极少。肺癌细胞进入淋巴管是肺癌淋巴转移的主要途径，淋巴转移患者的预后较差，为研究GS-Rg3对淋巴管生成的影响，我们建立了人肺癌裸鼠原位移植模型，并分别使用GS-Rg3干预，通过HE染色监测肿瘤建模情况和淋巴转移情况。结果显示模型组淋巴转移率为78.95%，而GS-Rg3可显著抑制淋巴转移情况，并且GS-Rg3也显著抑制肿瘤的质量和体积。为进一步分析GS-Rg3对淋巴管生成的影响，我们使用podoplanin蛋白标记淋巴管，结果显示模型组淋巴管较为丰富，而GS-Rg3可抑制podoplanin蛋白表达水平，减少淋巴管生成。国内已有临床研究显示GS-Rg3在治疗中晚期肺癌中的作用[11]，并且也有动物体内实验证实通过纳米材料递送GS-Rg3可以抑制小鼠肺癌模型的生长[12]。国外也有研究显示，GS-Rg3在异种移植小鼠模型中可以降低肿瘤体积和重量，并通过尾静脉注射显着降低肺组织中的肿瘤转移结节，GS-Rg3可通过下调FUT4介导的EGFR失活和阻断MAPK和NF-κB信号通路来抑制上皮间充质转化过程和肺癌的侵袭，研究还认为GS-Rg3可能是治疗肺癌的潜在有效药物[13]。此外，Rg3在异种移植小鼠模型中降低肿瘤体积和重量，并通过尾静脉注射显着降低肺组织中的肿瘤转移结节。戴晓军等[14]研究也发现了GS-Rg3对淋巴管生成中的抑制作用。这说明GS-Rg3可以通过抑制肺癌组织中淋巴管的生成抑制淋巴转移。这说明了GS-Rg3可以抑制肺癌的生长以及荷瘤裸鼠肿瘤组织中的淋巴管的生成，从而减少了肺癌的淋巴转移。为进一步分析GS-Rg3抑制淋巴管生成的机制，使用ERK抑制剂SCH772984作为阳性对照，分析其对TGF-β1/ERK信号通路和VEGF的表达水平的影响。TGF-β1/ERK信号通路在肺癌组织中过表达，并可通过调节细胞周期、凋亡以及上皮间充质转化等相关蛋白促进肺癌的增殖、转移并抑制其凋亡，而抑制TGF-β1/ERK信号通路可有效的抑制肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡，并且具有抑制肿瘤组织血管生成、淋巴管生成的作用[15]。VEGF可以高度特异性的促血管内皮细胞生长，不但可以促进肿瘤组织血管生长，还具有促进迁移侵袭的作用，此外，VEGF也具有促进淋巴管内皮细胞生长的作用，几乎在所有的肿瘤组织中VEGF的表达水平均上调。上调VEGF的表达可促进血管和淋巴管的生长从而为肿瘤生长提供养分养料以及促进肿瘤的转移，并且抑制VEGF的表达也是有效减少肿瘤生长和抑制肿瘤转移的方法[16]。本次研究结果显示SCH772984可以抑制肺癌原位移植瘤组织中的淋巴管生成，并且GS-Rg3和SCH772984可以显著抑制TGF-β1和ERK mRNA的表达，并且GS-Rg3和SCH772984可以显著抑制ERK磷酸化，抑制TGF-β1/ERK信号通路转导，并抑制VEGF-C、VEGF-3蛋白的表达。TGF-β1/ERK信号通路被激活后会促进多种肿瘤相关蛋白的表达，抑制TGFβ信号通路抑制VEGF的表达，从而减少肿瘤细胞浸润[17]。Liu等[18]的研究也发现抑制ERK通路也具有抑制VEGF表达的作用，从而抑制胰腺癌的血管生成。也有研究显示VEGF等蛋白的过表达也可以激活ERK等相关通路促进肿瘤细胞的迁移和侵袭引起肿瘤的转移和淋巴转移[19]。Tang等[20]的研究显示GS-Rg3可通过抑制TGF-β/Smad和ERK信号通路在体外抑制瘢痕成纤维细胞增殖以及血管生成，说明GS-Rg3具有抑制制TGF-β以及ERK信号通路的作用。Cao等[21]的研究发现GS-Rg3可以抑制子宫内膜异位症大鼠VEGF的表达。国内也有研究显示在原代喉鳞癌细胞以及人喉鳞癌裸鼠移植瘤中，GS-Rg3可以抑制TGF-β、VEGF-C蛋白的表达[22-23]。这提示在人肺癌裸鼠原位移植中，GS-Rg3可能通过抑制TGF-β1/ERK信号通路调节VEGF的水平，从而抑制肿瘤组织中淋巴管的生成，从而减少肿瘤的淋巴转移。