木犀草素对喉癌Hep2细胞凋亡的影响

张雪燕，李蕾蕾,石晓丽，霍峻锋，刘晓洁，秦甜甜，刘卫华，申益维，宋永安，王 淙

1)郑州大学药物研究院 郑州 450001 2)青岛大学附属医院药剂科 山东青岛 266033 3)郑州大学人民医院呼吸内科 郑州 450003

【基金项目】河南省基础与前沿技术研究项目(152300410030)；河南省高等学校重点科研项目(18A350013, 14B350011)

【作者简介】王淙，通信作者，女，1972年10月生，博士，副教授，研究方向：肿瘤药理，E-mail:wangcong@zzu.edu.cn

Luteolin significantly inhibited Hep2 cells survival in a time- and concentration-dependent manner(P<0.001). Luteolin induced apoptosis and apoptotic bodies were observed in Hep2 cells. Western blot showed that luteolin increased the expressions of Bax and Bid, while reduced the expression of Bcl-2(P<0.001).Conclusion:Luteolin induces apoptosis of Hep2 cells by upregulating Bax and Bid proteins and downregulating Bcl-2 protein.

喉癌是原发于头颈部的恶性肿瘤，较为常见的是鳞状细胞癌，占比高达95%。早期喉癌患者的5 a生存率为45%～60%，目前主要采用手术和放射治疗，但术后多有发声障碍[1-2]，影响患者的生活质量。寻找有效的化疗药物是目前治疗喉癌的重点。木犀草素是一种来源于天然植物的化合物，多见于芹菜、青椒等蔬菜中，具有多种生物学活性，可以保护神经系统、提高免疫力、清除自由基，临床多用于抗菌消炎、治疗心血管疾病和神经系统疾病等。近年来，研究[3-5]表明木犀草素可以通过EGFR通路抑制乳腺癌细胞的生长；通过CREB1通路抑制结直肠癌细胞的上皮间质化转变；通过抑制STAT3通路诱导乳腺癌细胞凋亡等。本研究观察了木犀草素对喉癌Hep2细胞凋亡的影响并探讨可能的作用机制，为喉癌药物的研发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂木犀草素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，Hep2细胞由郑州大学药物研究院保存。细胞培养基RPMI 1640和标准胎牛血清(以色列BI公司)，胰蛋白酶和BCA蛋白定量试剂盒、Hoechst 33258和曲拉通溶液(北京索莱宝公司)，β-actin和羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，ECL发光液(美国Therom Fisher公司)。磺酰罗丹明B(SRB，大连美仑生物科技公司)，鼠抗人Bax、兔抗人Bcl-2和Bid抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2细胞培养Hep2细胞用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2恒温加湿培养箱中培养。2～3 d传代1次，每2 d更换培养基。

1.3细胞存活情况检测收集对数生长期细胞，以2×103个/孔均匀铺至96孔板，置培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，将200 μL含不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和32.0、64.0和128.0 μmol/L)木犀草素的培养基加入96孔板中，每个浓度设置3个复孔，并设阴性对照(0.0 μmol/L木犀草素)组。24、48或72 h后，每孔加入150 μL 4 ℃预冷的三氯乙酸溶液，置4 ℃冰箱固定细胞30 min，去离子水冲洗3遍，室温晾干。每孔加入70 μL体积分数0.4%的SRB染液，染色30 min后弃染液，用体积分数1%的乙酸冲洗4次，室温晾干，100 μL Tris碱性溶液(pH 10.5)溶解染料，摇床振荡20 min后，测定560 nm波长下的吸光度(A)值。细胞存活率=实验孔A值/对照孔A值×100%。

1.4细胞凋亡的Annexin V-FITC/PI双染法检测将Hep2细胞按照4×105个/孔均匀铺至6孔板，待细胞贴壁后，更换含有不同浓度(0、10、20、40 μmol/L)木犀草素的培养基，培养箱孵育48 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化、收集细胞；PBS洗涤细胞，加入Binding Buffer悬浮细胞，再分别加入各5 μL的Annexin V-FITC和PI溶液，室温避光染色15 min，上流式细胞仪检测。

1.5凋亡小体的Hoechst33258染色收集处于对数生长期的Hep2细胞并计数，以1.5×105个/孔接种于6孔板中，置细胞培养箱中过夜，待细胞贴壁后，加入含0、10、20和40 μmol/L木犀草素的培养基孵育24 h，弃培养基，每孔加入1 mL甲醇30 min。PBS清洗2次，每孔加入1 mL Hoechst 33258和1 μL曲拉通溶液染色30 min。PBS清洗2次，荧光显微镜下拍照。

1.6凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Bid的Western blot检测Hep2细胞分别用0、10、20、40 μmol/L木犀草素处理24 h，胰蛋白酶消化，收集后PBS清洗2遍，加入裂解液混匀后离心，BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白样品中加入6×Loading Buffer，100 ℃变性10 min，4 ℃保存备用。SDS-PAGE法分离蛋白质并转移至硝酸纤维素膜，用TBST(含Tween 20的Tris缓冲盐，pH 7.8)配制的封闭液室温下封闭2 h。加入Bax、Bcl-2和Bid一抗(均稀释1 000倍)4 ℃孵育过夜。洗膜后室温下加入二抗孵育2 h。膜上加上适量发光液，暗室曝光。用Image J软件分析，以目的蛋白与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.7统计学处理采用SPSS 20.0分析。不同浓度木犀草素作用不同时间后各组Hep2细胞存活率的比较采用析因设计的方差分析；各组细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达的比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1木犀草素对Hep2细胞存活情况的影响木犀草素呈时间和浓度依赖性地抑制Hep2细胞存活(表1)，24 、48 、72 h的IC50分别为49.65、10.93 、 7.97 μmol/L。

表1 不同浓度木犀草素作用不同时间对Hep2细胞存活率的影响(n=3) %

F浓度=2 819.258，F时间=242.012,F交互=210.793，P均<0.001

2.2各组Hep2细胞凋亡率比较结果见表2。

表2 各组Hep2细胞凋亡率比较 %

各指标组间两两比较，P均<0.05

2.3各组Hep2细胞凋亡情况0 μmol/L木犀草素组细胞核形态规则，蓝色荧光分布均匀，而随着木犀草素浓度的增加，细胞核内开始出现致密的蓝色颗粒状荧光，形成凋亡小体(图1)。

2.4各组Hep2细胞中凋亡相关蛋白表达的比较Hep2细胞中促凋亡蛋白Bax、Bid的表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，见图2、表3。

A、B、C、D：分别为0、10、20、40 μmol/L木犀草素组

1～4：分别为0、10、20、40 μmol/L木犀草素组

表3 各组Hep2细胞中凋亡相关蛋白表达水平的比较

各指标组间两两比较，P均<0.05

3 讨论

木犀草素属于天然黄酮类化合物，广泛存在于水果和蔬菜中。研究[6-10]表明木犀草素具有保护心血管、抗菌、抗炎等作用，且通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、自噬和阻滞细胞周期等达到抑癌效果。细胞凋亡是细胞自主性、程序性的死亡，可以维持细胞内环境的稳定，有利于维持细胞存活和死亡之间的平衡。细胞凋亡分为内源性和外源性细胞凋亡，内源性细胞凋亡由线粒体控制，又称为线粒体途径凋亡。Bcl-2家族是线粒体凋亡途径的重要调控者[11]，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的两个主要成员[12]，通过形成同源二聚体或者异源二聚体调控细胞凋亡。Bcl-2蛋白或者其同源二聚体占优势会抑制细胞凋亡；Bax蛋白或者其同源二聚体占优势则诱导细胞凋亡[13]。Bid蛋白是Bax家族的一员，可诱导细胞凋亡[14]。

该研究结果表明，木犀草素可抑制Hep2细胞的生存，24、48、72 h的IC50分别为49.65、10.93、7.97 μmol/L,因此后续实验中选用0、10、20、40 μmol/L作为木犀草素的实验浓度。木犀草素能诱导Hep2细胞凋亡，Hep2细胞早期凋亡率和晚期凋亡率随木犀草素作用浓度的增大而增加； Hoechst染色实验结果表明随着木犀草素浓度的增加，细胞核内开始出现凋亡小体，进一步提示木犀草素可以诱导喉癌细胞的凋亡。本研究的结果亦表明，木犀草素可以浓度依赖性地抑制Hep2细胞的存活，促进Hep2细胞的凋亡，其具体机制与诱导线粒体凋亡途径凋亡相关蛋白Bax和Bid的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关。

综上所述，木犀草素通过增加凋亡蛋白表达，抑制抗凋亡蛋白表达来促进Hep2细胞的凋亡，本研究为木犀草素在治疗喉癌中的作用提供了参考。