BHMT rs3733890基因多态性与叶酸治疗河南汉族HHcy患者效果的前瞻性队列研究

任炳楠，王连珂，田丹丹，王文华，田惠子，韩 涵，岳利敏，杜冰会，张卫东

1)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州 450001 2)河南省人民医院高血压科 郑州 450003 3)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)作为一种含硫氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间产物。健康成人空腹血浆Hcy水平是5～15 μmol/L，高于15 μmol/L可被诊断为高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)[1-3]。已经发现一些Hcy代谢相关的酶基因突变，或者一些特殊环境因素(如B族维生素缺乏等)均可导致Hcy代谢的紊乱，引起Hcy水平的异常升高，HHcy作为多种心血管疾病的独立危险因素，已经严重威胁到了人类健康[4-5]。目前，口服叶酸作为最常见的治疗手段，长期服用可以显著降低20%～30%的总体Hcy水平[6-9]，但叶酸对于HHcy的治疗效果仍然存在很大争议，有许多病例疗效仍不理想。大部分研究仅仅报道了叶酸长期补充后血浆Hcy水平的下降情况，而Hcy是否降至正常水平却很少有人关注。

甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶(Betaine-homocysteine methyltransferase, BHMT)参与了Hcy的再甲基代谢过程，其不依赖于维生素B12，并只活跃于肝肾细胞中[10]。人类的BHMT基因位于5号染色体，rs3733890是常见的突变位点，该多态性已经被证实同神经管畸形、唐氏综合征、唇腭裂、宫颈癌、乳腺癌、头颈部癌等多种疾病有关[11-16]。在该研究中，作者将探讨BHMT rs3733890多态性与叶酸治疗HHcy效果的关联性，并分析基因-环境交互作用对疗效的影响。

1 材料与方法

1.1研究对象作者建立了一个前瞻性队列研究，筛选于2014年7月至12月在郑州大学第五附属医院神经内科就诊的汉族患者作为研究对象。纳入标准：①血浆Hcy水平>15 μmol/L，被诊断为HHcy。②年龄在18岁以上。③自愿参与本研究并接受90 d的叶酸补充治疗。患者有以下任一条件则被排除：①使用过口服避孕药。②患有严重感染、肝肾疾病、血液疾病、消化系统疾病、甲状腺功能异常或恶性肿瘤。③过去2周内服用过B族维生素、抗癫痫药、降压药、他汀类药物或其他影响Hcy代谢的药物(如甲氨蝶呤、阿司匹林等)。本研究由郑州大学生命科学伦理审查委员会批准，所有患者或其亲属签署知情同意书。

1.2基线调查与随访所有纳入研究的患者均接受为期90 d的口服叶酸(5 mg/d)干预治疗。通过调查问卷，在研究开始前收集患者的社会人口学资料(如年龄、性别、婚姻状况等)和临床信息。在干预治疗前采集所有患者空腹静脉血检测Hcy。分别于治疗中期(第45天)和治疗结束时(第90天)进行2次电话随访，对服药依从性进行评估。此外，于治疗结束时进行第2次血浆Hcy水平的检测。

1.3疗效评估标准与分组依据根据第2次血浆Hcy水平评估疗效。如Hcy水平≤15 μmol/L，认为叶酸干预治疗有效，患者被纳入治疗成功组。反之，则认为干预失败，患者被纳入治疗失败组。

1.4实验室检查与基因分型实验均在本课题组分子生物学实验室进行。使用荧光偏振免疫分析法检测空腹血浆Hcy水平。使用苯酚/氯仿提取全基因组DNA。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点的筛选标准为：①最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)>0.05。②连锁不平衡r2>0.8。③功能性SNP。使用Sequenom公司的时间飞行质谱生物芯片系统(MassArray系统)对BHMT rs3733890位点进行基因分型。

1.5统计学处理采用SPSS 20.0进行数据分析。根据连续变量的正态性和方差齐性，选择t检验或U检验比较两组间变量的差异；分类变量使用百分比表示，使用χ2检验比较两组间变量的差异。使用logistic回归分析BHMT rs3733890基因多态性与叶酸治疗效果的关联性。使用分层分析探究基因-环境的交互作用。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组患者基线特征的比较共有1 071例HHcy患者纳入本研究。在治疗过程中175例服药依从性较差或者中途失访被排除，253例2次随访的服药依从性均为一般，也从研究中排除。此外，有5例的基因型未被检出，未纳入分析。最终共有638例进入分析。结果见表1。由表1可知2组人群年龄、性别差异无统计学意义。治疗失败组吸烟、糖尿病、高血压、冠心病患者的比例、基线血浆Hcy水平均高于治疗成功组。

表1 2组基线特征比较

2.2BHMT rs3733890多态性与叶酸疗效的关联性该位点的基因型与等位基因在2组人群中的分布见表2。治疗成功组人群的基因型分布符合哈德温伯格平衡(χ2=0.06，P=0.972)。Logistic回归结果显示，相较于GG基因型携带者，AA型携带者叶酸治疗失败的风险更高。排除年龄、性别、吸烟、饮酒和婚姻状况的混杂影响以后，关联性依旧存在。

表2 BHMT rs3733890多态性与叶酸疗效的关联

*：调整年龄、性别、吸烟、饮酒、婚姻状况

2.3BHMT基因-环境交互作用对叶酸疗效的影响见表3。由表3可知，与携带野生型(GG)的不吸烟、不饮酒者相比较，携带突变基因型(GA+AA)的吸烟、饮酒患者叶酸治疗失败的风险显著升高。此外，突变基因型与糖尿病、高血压和冠心病史也存在着明显的协同作用，叶酸治疗失败风险显著升高。

表3 BHMT基因-环境交互作用对叶酸疗效的影响

3 讨论

HHcy作为一个危险因素，影响多种心血管疾病的发生和发展。大量的流行病学研究[4-8]已经证实，补充叶酸可以有效地降低血浆Hcy水平。然而，许多治疗无效的病例却没有得到广泛的关注。作者前期的研究[17]结果表明，在经过了90 d的叶酸(5 mg/d)补充以后，仍有超过40%的HHcy患者血浆Hcy水平没有降至正常(5～15 μmol/L)。但关于治疗失败的原因，仍没有一致的结论。

Hcy可以通过再甲基化过程形成蛋氨酸，这一过程包含两条途径。在最重要的第一条通路中，由5-甲基四氢叶酸作为甲基供体，在蛋氨酸合成酶的催化作用下，以维生素B12作为辅酶，将Hcy转化为蛋氨酸，可降低血浆中Hcy的水平。而另一条通路则只存在于肝肾细胞中，以甜菜碱作为甲基供体，在BHMT的催化作用下，不依赖于B族维生素的辅酶作用，将Hcy转化为蛋氨酸，并生成二甲基甘氨酸(dimethylglycine，DMG)[18]。作者先前在第一条代谢通路上的研究[19]已经证明，亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)的rs1801133和rs1801131位点，以及蛋氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase， MTRR)的rs1801394和rs162036位点的基因多态性同叶酸治疗HHcy的疗效存在关联，并且rs1801133位点与冠心病和高血压之间存在交互作用，直接影响到叶酸的治疗效果。而目前缺乏关于第二条代谢通路的研究，仅有少数研究[20]表明，BHMT基因功能的改变可能会引起Hcy水平的升高，并进一步导致血管疾病风险的上升。作者推测：BHMT rs3733890基因多态性可能影响叶酸治疗HHcy的效果，而基因-环境交互作用对于精准降Hcy可能有着更有效的预测作用。因此，作者通过在河南汉族HHcy人群中的前瞻性队列研究来系统性地分析这些问题。

该研究结果显示，BHMT rs3733890突变等位基因A和基因型可以升高叶酸治疗HHcy失败的风险；这一结果在排除相关混杂因素之后依旧成立。Li等[21]的研究发现，BHMT rs3733890位点发生错义突变以后，尽管不引起酶活性的改变，但突变基因蛋白产物的米氏常数更低，与甜菜碱和Hcy之间的亲和力更强，使再甲基反应更容易发生。然而，此反应也会产生过量的DMG。Liu等[22]研究结果显示，DMG与Hcy水平之间存在正相关，DMG水平可以作为总Hcy水平变化的预测因子。因此，这也解释了为什么携带突变基因的HHcy患者经过叶酸治疗以后失败比例更高。

Da等[11]在巴西人群中所做的研究发现，BHMT rs3733890 GA/AA基因型可与吸烟协同作用，升高头颈部鳞状细胞癌的发病风险。Hobbs等[23]的研究结果显示，相较于体重正常且携带有GG基因型的女性而言，携带GA/AA基因型的肥胖女性生育先天性心脏病孩子的概率升高了1.8倍。尽管关于BHMT基因-环境交互作用影响叶酸疗效的潜在机制尚未得到充分的研究，但有研究[11, 24]显示，乙醇和尼古丁等有害物质的摄入会改变叶酸摄入与总DNA甲基化水平之间的关联，提示吸烟和饮酒会通过影响体内一碳单位代谢，进一步影响到DNA的合成和甲基化水平。本研究结果也显示BHMT rs3733890多态性与一些环境因素间存在交互作用，突变基因型对叶酸治疗效果的影响被环境因素增强，导致了更高的失败风险。因此，作者推测，BHMT基因与环境的交互作用可能会通过改变Hcy代谢和DNA甲基化水平，影响叶酸治疗的结局。

总之，在河南汉族HHcy患者中，BHMT rs3733890基因多态性与口服叶酸治疗HHcy的效果存在密切关联，基因-环境的交互作用会直接影响到叶酸的疗效。然而，由于研究的样本量有限，并且在随访过程中存在着失访和依从性较差等问题，因此，在下一阶段，课题组将开展大型的多中心大样本的研究，提升依从性，进一步验证该研究结果。