金线莲及其混伪品中总黄酮含量的比较研究

张 超，易 骏，张若青，杨淑玲，叶 齐，吴建国，吴锦忠，吴岩斌，郑承剑

(1.福建中医药大学药学院,福建 福州 350122；2.福建教育学院理科部,福建 福州 350001；3.中国人民解放军天津康复疗养中心464医院药剂科，天津 300381；4.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002；5.海军军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)

金线莲(Herba Anoectochilus)是福建特色中草药，来源于兰科(Orchidaceae)金线兰属植物金线兰Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl.的全草，具有清热解毒、凉血、祛风利湿等功效[1-2]。现代药理研究表明金线莲具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗氧化、保肝、抗骨质疏松等药理作用[3-11]。除金线兰外，其他金线兰属植物包括：台湾银线兰A.formosanus、恒春银线兰A.koshunensis、浙江金线兰A.zhejiangensis、峨眉金线兰A.emeiensis、滇越金线兰A.chapaensis等，金线兰属植物在民间也混做金线莲使用[12-13]。另外，由于药材形态特征相似，在市场上常有一些同科不同属近缘种植物如：斑叶兰属植物斑叶兰GoodyeraschlechtendalianaRchb.f.、大花斑叶兰G.biflora(Lindl.) Hook.f.、毛梗斑叶兰G.hispidaLindl.、小小斑叶兰G.yangmeishanensiT.P.lin、天全斑叶兰G.wuanaT.Tang et F.T.wang、血叶兰属植物血叶兰Ludisiadiscolor(Ker-Gawl.) A.Rich.，经过干燥加工后作为金线莲的伪品[13]。黄酮类成分是金线莲主要的活性成分之一，具有抗氧化和降血糖等生物活性，也是衡量该药材质量的重要指标[14-15]。虽然已有文献报道过金线兰、台湾银线兰和滇越金线兰中的黄酮类成分[12,16-17]，但是关于其他金线莲混伪品中黄酮类成分却鲜见报道。本研究分析金线莲及其混伪品中总黄酮含量的差异，将为金线莲资源的开发利用和药材质量控制提供参考依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

UV-1800紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；RE-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；AB204-N电子天平(METTLER TOLEDO)；DFT-200手提式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)。

1.2 试剂

金线莲及其混淆品采自不同省市，经福建中医药大学药学院中药鉴定教研室黄泽豪教授鉴定；芦丁(成都普瑞法科技开发有限公司，批号：15010412，含量大于98%)；硝酸铝、氢氧化钠、甲醇、乙醇为分析纯；蒸馏水(实验室自制)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的芦丁对照品5.38 mg,置25 ml 容量瓶中，加10 ml乙醇溶解，加水至刻度，摇匀，即得每1 ml 中含芦丁0.2152 mg 的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取不同样品粉末约1.0 g，精密称定，置索氏提取器中，加70 ml石油醚加热回流提取至提取液无色，弃去石油醚液，药渣挥去石油醚，加95%乙醇继续提取至无色，提取液旋转浓缩至干，加入95%乙醇超声溶解，定容，得总黄酮上清液。

2.3 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液1、2、3、4、5、6 ml，分别置25ml容量瓶中，加水至6.0ml，再加5%亚硝酸钠溶液1 ml，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠试液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，在510 nm波长处测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，相应浓度(C)为横坐标，计算得到总黄酮含量测定的回归方程：A=0.0111C-0.0097(r= 0.9996)，结果表明芦丁在8.61～51.65 μg/ml范围内线性良好。

2.4 方法学考察

2.4.1精密度试验

精密吸取“2.1”项下制备的芦丁对照品溶液(215.2 μg/ml)6份，按“2.3”项下方法测定吸光度,计算结果显示6份芦丁对照品反应后的吸光度的RSD为0.46%，表明该方法的精密度良好。

2.4.2重复性试验

取同一批样品(序号8)1.0 g，平行称取6份，按“2.2”项下处理，按“2.3”项下方法测定吸光度,计算结果显示6份金线莲样品总黄酮反应体系的吸光度RSD为2.66%，表明该方法测定金线莲总黄酮的含量重复性良好。

2.4.3稳定性试验

取同一批样品(序号8)1.0g，按“2.2”项下处理，按“2.3”项下方法测定吸光度，分别每隔10 min记录吸光度,计算结果显示该金线莲总黄酮反应体系的吸光度在120 min内RSD为0.97%，表明该反应体系在120 min内稳定性良好。

2.4.4回收率试验

取已知含有量的样品(序号8)0.5 g，平行称定6份，按照“2.2”项下供试品溶液的制备方法提取总黄酮，分别取3 ml供试液置于6支25 ml容量瓶中，再分别加入2.37 mg芦丁对照品，按“2.3”项下方法测定吸光度,并计算总黄酮含量，计算回收率和RSD。回收率结果见表1，结果显示，金线莲总黄酮的平均回收率为98.85%，RSD为2.91%，表明金线莲总黄酮的加样回收率良好。

表1 金线莲总黄酮加样回收试验结果(n=6)

2.5 样品含量的测定

精密吸取供试品溶液3 ml置25 ml容量瓶中，照“2.3”项下的方法，自“加水至6.0 ml”起，依法测定吸光度，每批样品平行3次，根据标准曲线计算总黄酮含量，结果见表2。

7批来源于野生金线莲的样品总黄酮含量在5.90～15.17 mg/g之间，均值为9.93 mg/g，RSD为33.04%，来源于广东清远的野生金线莲样品总黄酮含量最高，为15.17 mg/g；5批组培金线莲样品的总黄酮含量在3.89～5.57 mg/g之间，均值为4.50 mg/g，RSD为15.33%；5批组培台湾银线兰样品的总黄酮含量在3.66～9.91 mg/g，均值为6.59 mg/g，RSD为44.30%；其余7种野生金线兰属样品总黄酮含量在6.88～9.19mg/g之间；4种斑叶兰属植物(斑叶兰、大花斑叶兰、小小斑叶兰、天全斑叶兰)和1种血叶兰属植物(血叶兰)，它们的总黄酮含量分别为21.96、9.66、11.10、12.70和4.82mg/g。

表2 金线莲及其混伪品中总黄酮的含量(n=3)

注：AR 8-12分别是来自不同企业的组培金线兰；AF 1-5分别是来自不同企业的组培台湾银线兰；其余样品均为野生。

3 讨论和结论

金线莲已成为福建省特色中药材“福九味”之一，但其来源混杂、混伪品多，导致药材质量良莠不齐，影响到临床用药的有效性和安全性。目前，市场上金线莲的主要伪品为斑叶兰属植物和血叶兰的全草，主要的混淆品或地方习用品为台湾银线兰、滇越金线兰等金线兰属植物。本研究采集了30批次不同来源的金线莲及其混淆品和伪品，包括金线兰、台湾银线兰、兴仁金线兰、丽蕾金线兰、南丹金线兰、长片金线兰、滇南金线兰、短唇金线兰、高金线兰、斑叶兰、大花斑叶兰、小小斑叶兰、天全斑叶兰、血叶兰，其中短唇金线兰和高金线兰为课题组在中国首次发现的金线兰属植物，其植物形态与金线兰极其相似，在云南省也被当作金线莲使用[18-19]。

金线莲为全草类中药，色素较多，本试验通过石油醚回流提取后，再采用乙醇提取总黄酮，可以减少其他类成分对总黄酮含量测定的干扰。试验结果显示，金线莲及其混淆品、伪品的总黄酮含量存在差异。12批次的金线莲总黄酮含量在3.89～15.17 mg/g之间，其余金线莲混淆品和伪品的总黄酮含量在3.66～21.96 mg/g之间。不同产地的野生金线莲总黄酮含量存在差异，这可能与其生长年限和生长环境等因素有关；不同厂家的组培金线莲和台湾银线兰的总黄酮含量差别较大，这可能与不同厂家生产组培品所用的外植体不同有关，此外组织培养所用的培养基、光照、温度等也可能对总黄酮的积累产生影响；金线莲与其混淆品、伪品中总黄酮的含量差异可能与种的不同及其生长环境有关。黄酮含量的高低，仅可作为金线莲质量评价的标准之一，若要全面地评价金线莲的质量,还应当对其多糖、内酯苷等成分进行系统的研究。