PNB/TCH生长试验和DNA微阵列基因芯片鉴定非结核分枝杆菌的价值比较

王建 胡立珍 张国翠 赵辉 陈子芳

摘要：目的  比较对硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼生长（PNB/TCH）和DNA微阵列基因芯片鉴定非结核分枝杆菌（NTM）临床分离株菌种的价值。方法  收集2013年1月～2018年6月我院住院患者的痰分枝杆菌培阳分离菌2175株，分别采用PNB/TCH生长试验和DNA微阵列基因芯片鉴别NTM，比较两种方法的鉴定结果。结果  PNB/TCH生长试验初步鉴定NTM 93株，占4.28%，DNA微阵列基因芯片鉴定NTM 79株，占3.63%，PNB/TCH生长试验初步鉴定的93株NTM中，有14例为假NTM（15.05%）;PNB/TCH生长试验鉴定NTM的阳性检出率低于DNA微阵列基因芯片;79株NTM中，占比前3位的依次为胞内分枝杆菌株（37.97%）、堪萨斯分枝杆菌（21.52%）、鸟分枝杆菌（16.46%）。结论  传统对硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼生长试验鉴定NTM特异性较低，采用DNA微阵列基因芯片技术鉴定NTM准确，临床参考价值较大。

关键词：非结核分枝杆菌;PNB/TCH;基因芯片;菌种鉴定

中图分类号：R440                                   文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.20.054

文章編号：1006-1959（2019）20-0170-02

Comparison of PNB/TCH Growth and DNA Microarray Gene Chips for

Identification of Nontuberculous Mycobacteria

WANG Jian1，HU Li-zhen1，ZHANG Guo-cui1，ZHAO Hui2，CHEN Zi-fang1

Abstract：Objective  To compare the growth of non-tuberculous mycobacteria （NTM） clinical isolates with p-nitrobenzoic acid/thiophene-2-carboxylate growth （PNB/TCH） and DNA microarray microarray.Methods  A total of 2175 strains of Mycobacterium phlei isolates in our hospital from January 2013 to June 2018 were collected. PNB/TCH growth test and DNA microarray gene chip were used to identify NTM. Identification of the method.Results  PNB/TCH growth assay initially identified NTM 93 strain， accounting for 4.28%， DNA microarray gene chip identified NTM 79 strain， accounting for 3.63%， and of the 93 NTMs initially identified by PNB/TCH growth test， 14 were pseudo NTM （ 15.05%）; PNB/TCH growth test identified that the positive detection rate of NTM was lower than that of DNA microarray gene chip; among the 79 strains of NTM， the top 3 were followed by intracellular branching strain （37.97%）， Kansas Mycobacterium （21.52%）， Mycobacterium avium （16.46%）. Conclusion  The traditional p-nitrobenzoic acid/thiophene-2-carboxylic acid oxime growth test has low specificity of NTM. The DNA microarray gene chip technology is used to identify NTM accurately， and the clinical reference value is large.

Key words：Non-tuberculous mycobacteria;PNB/TCH;Gene chip;Strain identification

近年来，非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）发病率有逐年升高趋势。全国结核病流行病学调查显示，NTM发病率1984～1985年为4.2%，1990年为4.9%，2000年为11.1%，而2010年增至22.9%[1]。随着NTM发病率逐年升高，临床对NTM的诊断和鉴别诊断尤为重要，早期确诊有助于临床及时治疗，在一定程度上避免误诊误治。研究显示，传统对硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼（PNB/TCH）生长试验可初步鉴定NTM，但不能鉴定菌种。DNA微阵列基因芯片可鉴定17种分枝杆菌，具有较高的鉴定价值。本研究收集2013年1月～2018年6月滨州市结核病防治院住院患者痰培养阳性分枝杆菌2175株，分别采用PNB/TCH生长试验和DNA微阵列基因芯片法鉴定分枝杆菌菌种，旨以评价两种方法在结核病临床诊断和鉴别诊断中的价值，现报道如下。

1材料与方法

1.1菌株来源  选择2013年1月～2018年6月滨州市结核病防治院住院肺结核患者痰培养阳性分离菌株2175株（例）;培阳分离菌株患者中男性1264例，女性911例，年龄19～76岁，平均年龄（48.01±13.07）岁。所有痰培养采用酸性罗氏培养法，酸性罗氏培养基由珠海贝索生物技术有限公司提供，实验严格按《结核病实验室检验规程》操作[2]。

1.2方法

1.2.1 PNB/TCH生长试验  将PNB用二甲基甲酰胺溶解稀释后加入未凝固的改良罗氏培养基中，最终浓度控制在0.5 mg/ml;TCH用灭菌蒸馏水溶解，培养基中最终浓度为5 μg/ml。PNB/TCH生长试验按《结核病实验室检验规程》进行[2]。

1.2.2 DNA微阵列基因芯片法  DNA微阵列基因芯片检测利用TM-Ⅱ芯片杂交仪、TM8芯片洗干仪、10K-B芯片扫描仪等设备，试剂为晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（DNA微阵列芯片法），由博奥生物有限公司提供。分别用无菌取菌环挑取1个肉眼可见的菌落，加入含50 μl核酸提取液的核酸提取管中，使用核酸提取仪震荡5 min，确保菌株完全破碎，将核酸提取管置于95℃水浴5 min，取出核酸提取管，5000 r/min离心1 min，所得核酸进行PCR扩增、芯片杂交和扫描判读。结核分枝杆菌耐多药检测和分枝杆菌菌种鉴定实验，严格按基因芯片法标准操作规程进行。

1.3質量控制  PNB/TCH生长试验质量控制按《结核病实验室检验规程》[2]要求进行;DNA微阵列基因芯片法每个标本进行鉴定检测时，芯片内部设有内部质控。1个分枝杆菌属质控，1个结核分枝杆菌质控，2个芯片制备质控，2个芯片杂交质控，1个空白对照质控，1个阴性对照质控，以及靶基因ropB、KatG和inhA扩增质控。如果其中任何一个质控结果错误，则标本结果定位无效，需要进行复检。

1.4统计学方法  建立Excel数据库收集数据，运用SPSS 17.0软件进行数据处理，阳性检出率采用（n，%）表示。

2结果

2.1分枝杆菌鉴定结果  2175株分枝杆菌经PNB/TCH生长试验和DNA微阵列基因芯片鉴定，分别检出NTM 93株和79株，MTB菌株分别为2082株和2096株;在PNB/TCH生长试验初步鉴定的93株NTM中，有14例为假NTM，占15.05%（14/93）;PNB/TCH生长试验阳性检出率为99.36%（2161/2175），低于DNA微阵列基因芯片法的100.00%（2175/2175）。

2.2 NTM菌种分布情况  79株NTM中，胞内分枝杆菌30株（37.97%）、堪萨斯分枝杆菌17株（21.52%）、鸟分枝杆菌13株（16.46%）、戈登分枝杆菌9株（11.39%）、草分枝杆菌6株（7.60%）、龟/脓肿分枝杆菌 4株（5.06 %）。

3讨论

目前，NTM对人类健康的威胁越来越受到临床重视，NTM感染在患者之间的传播很少，绝大多数感染是环境中细菌引起的，这与肺结核通过人与人之间传播有很大差异。传统NTM的初步鉴定依据PNB/TCH生长试验，但该方法存在一定的局限性，受到多种因素的影响：①接种PNB/TCH菌液的浓度;②化疗对分枝杆菌活力损伤的程度;③培养基营养成分的限制性;④培养基保存时间对PNB/TCH药效的影响。特别是商品化PNB/TCH培养基有效期（1个月）的延长，使得PNB/TCH药效下降，在鉴定中容易出现假阳性菌株。DNA微阵列基因芯片鉴定是以PCR扩增为基础，其特异性和敏感性均较高，该法不仅可用于菌株的鉴定，还可直接用于涂阳标本的鉴定，因而可以在疾病早期诊断菌株感染情况。

刘海灿等[3]报道，450株被初步鉴定为非结核分枝杆菌的临床分离菌株中，经基因测序等分子生物学方法检测，有45株被鉴定为结核分枝杆菌，约占10%。柳正卫等[4]报道，70株初步鉴定为非结核分枝杆菌的菌株，经过DNA微阵列芯片法和16 sRNA测序法再次菌种鉴定检测，61.43%（43/70）为结核分枝杆菌。均验证了DNA微阵列技术鉴定分枝杆菌的特异性高于PNB/TCH生长试验。本研究结果显示，2175株分枝杆菌经PNB/TCH生长试验和DNA微阵列基因芯片鉴定分别检出结核分枝杆菌2082株和2096株，检出NTM 93株和79株，而在PNB/TCH生长试验初步鉴定的93株NTM中，有14例为假NTM，占15.05%（14/93）。与上述报道结果基本一致。因治疗肺结核病和NTM感染的方案差异较大，因而鉴定NTM菌株对临床诊治有重要意义。

本研究结果显示，79株NTM中胞内分枝杆菌株占比最高，为37.97%，其次为堪萨斯分枝杆菌和鸟分枝杆菌，分别占21.52%和16.46%。有研究显示，北京市721株分枝杆菌检出NTM 93株（12.9%），以脓肿分枝杆菌占首位;衢州地区NTM检出率为3.93%，以胞内分枝杆菌株居多（占52.69%）[5]。与本次研究结果不同，可见NTM发病率不同地区相差悬殊，可能与生存环境及生活习性等有关。

综上所述，传统对硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼生长试验鉴定NTM特异性较低，采用DNA微阵列基因芯片技术鉴定NTM准确，临床参考价值较大。

参考文献：

[1]全国第五次结核病抽样调查技术指导组，全国第五次结核病抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志，2012，34（8）：485-508.

[2]赵雁林，逄宇.结核病实验室检验规程[M].北京：人民卫生出版社，2015.

[3]刘海灿，黄明翔，蒋毅，等.福建省肺非结核分枝杆菌临床分离株的菌种鉴定[J].中国人兽共患病学报，2017，33（5）：389-397.

[4]柳正卫，吴蓓蓓，郑琳，等.微阵列芯片技术应用于分枝杆菌菌种鉴定的研究[J].浙江预防医学，2013，25（8）：1-4.

[5]余旭泉，徐礼锋，祝进，等.99株分枝杆菌菌种鉴定和耐药检测结果分析[J].中国卫生检验杂志，2015，25（20）：3580-3582.

收稿日期：2019-6-25;修回日期：2019-7-19

编辑/钱洪飞