酒精发酵液中组分的对标分析

李红霞

摘      要：酒精发酵液中乙醇、糖、有机酸等含量的高低，体现了发酵水平，因此利用高效液相色谱法进行成分分析是关键。在液相色谱仪（HPLC）的定量分析中，因样品前处理方法、标准品配制、仪器参数的设置、色谱图积分方式等的不同，造成测定存在系统误差。操作方法统一，把误差减少到最小，使酒精发酵液质量与发酵水平提高。

关  键  词：酒精发酵液;乙醇;糖;系统误差

中图分类号：O652             文献标识码： A      文章编号： 1671-0460（2019）10-2403-04

Abstract： The content of ethanolP-aminobenzenesulfonic acid-naphthylamine hydrochloride spectrophotometry，sugar and organic acid in alcohol fermentation liquid reflects the level of fermentation and guides the improvement of production technology. Therefore， the correct use of high-performance liquid chromatography is the key to component analysis. In the quantitative analysis of liquid chromatography， there are systematic errors in the determination due to differences in sample pretreatment methods， preparation of standard products， setting of instrument parameters， and chromatographic integration methods. In this paper， the methods of these operation were unified， the error was reduced to the minimum level， and the quality of alcohol fermentation liquid and the level of fermentation were improved.

Key words： Alcohol fermentation liquid; Ethanol; Sugar; System error

高效液相色譜定量分析过程可分为样品的前处理、标准品的配制、进样、色谱分离、检测及数据处理等七个步骤[1]。尤其在高效液相色谱定量分析中，实验结果的误差可能主要来源于样品的前处理及标准品的配制、操作细节、积分方式。不同的检测方法检测误差较大，同一种检测方法，也要细化细节，才能得出较为准确的数据。

利用HPLC对酒精发酵液各组分的分析，现采用的是结合国标优化后的检测方法，而同行业公司采用的是诺维信公司应用的方法。诺维信的酒精发酵液检测方法已在全球对标。为了与同行业生产情况进行对比、为技术改进、过程控制提供强数据支持，现利用诺维信方法进行糖谱分析，同时诺维信公司对同一样品进行分析对比，找出检测误差，统一公司内部检测方法，把误差减少到最小范围。

误差按其性质和产生原因，可分为系统误差、随机误差和过失误差。系统误差又称可测误差、恒定误差或偏倚。指测量值的总体均值与真值之间的差别，是由测量过程中某些恒定因素造成的，在一定条件下具有重现性，并不因增加测量次数而减少系统误差，它的产生可以是方法、仪器、试剂、恒定的操作人员和恒定的环境所造成。我们主要研究的是系统误差。

1  实验部分

1.1  仪器

1.1.1  安捷伦液相色谱仪 1200

G1311A 四元泵、G1316A 恒温箱、G1329A自动进样器、G1362A 示差折光检测器。

1.1.2  色谱柱

BIO-RAD Aminex HPX-87H （300 mm×7.8 mm）;保护柱;将BIO-RAD 预柱Micro-Guard Cation H cartridge（Cat.nr.125-0129）装入与其匹配的BIO-RAD 标准套筒中  （Cat.no.125-0131），用一根 10 cm×0.15 mm ID 的不锈钢细管将其与分析柱相连。

1.1.3  离心机

转速可以达到4 000 r/min。

1.1.4  其他

分析天平、移液管、直吸管、容量瓶等。

1.2  分离机理

高效液相色谱法（HPLC）按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。离子分配色谱法是一种利用 HPLC 通过离子交换树脂来分离极性非离子化合物的方法。其分离机制不同于离子交换，而由分子排阻和基团交换组成。树脂上的电荷提供了离子排阻的能力，而聚苯乙烯主链则提供了疏水相互作用。根据不同的化合物和选择性的程度，可选择运用一个或多个分离机制。

在寡聚糖的分离过程中，分子排阻是最主要的分离机制。尺寸过大的分子无法渗透进入离子交换树脂的孔结构中而首先被洗脱出来。尺寸较小的分子，如单糖、二糖、三糖和一些短链的低聚糖，可以进入树脂的内孔而逐步洗脱。

1.3  主要试剂

麦芽三糖：Sigma，  W=504.4， >95%;

麦芽糖：Sigma， MW=360.3， >99%;

葡萄糖：Sigma， MW=180.2， >99.5%;

果糖：Sigma， MW=180.2， <0.05mol% 葡萄糖;

乙醇：Chem Service，  MW=46， 99.5%;

乳酸：Sigma，， MW-90.08， >98%;

乙酸：TEDIA， MW=60.08， >99.7%;

甘油：Chem Service， MW=92， 99%;

硫酸：AR，98%。

1.4  流动相配制

1.8 mol/L H2SO4的配制：取90 mL 蒸馏水于烧杯中，用10 mL 移液管吸取10 mL 浓硫酸，在搅拌的状态下缓慢加入到90 mL 水中，使其充分混匀。

0.005 mol/L H2SO4溶液的配制：用0.22μm的过滤器过滤上述溶液约5～20 mL备用。用移液器吸取过滤液11.12 mL，到已预先放入蒸馏水的2 L容量瓶中，用水定容量瓶刻度线，充分混匀。用超声波脱气20 min。

1.5  混合标准的配制

取一定质量的各种标品，以蒸馏水溶解并定容到 100 mL，混合均匀，配制成混合标准样，标准含量过少可用稀释法，配制多级标准（表1）。

1.6  样品预处理[2]

将样品混合均匀，取适量样品于带盖离心管中，室温下4 000 r/min离心5 min;用5 mL的注射器将上清液通过 0.22μm滤膜，注入到2 mL 的样品瓶中，盖紧瓶帽。同样的方法将标准品进行过滤。

1.7  仪器参数[3，4]

色谱柱：Aminex HPX-87H， 7.8 mm×300 mm;

流动相： 0.005 mol/L H2SO4;

温度： 65 ℃;

流速：0.6 mL/min;

进样量： 15μL;

检测器： 折光检测器;

分析时间： 30 min。

2  对标分析

第一次对标数据及分析见表2-3。

结果表明：控制值=偏差÷平均值×100%;麦芽糖、甘油、乙醇数据符合控制要求。其他仍需要继续对标。

3  结果分析

3.1  标准试剂不统一带来的误差

作为标准溶液使用的标准物质其纯度要求很高，应避免使用纯度不符合要求[5]的试剂，不同的试剂厂家的试剂纯度不同，直接影响到检测结果，标准的准确是检测结果准确的保证，减少误差有三种方法：一是购买权威标准厂家的标准，二是统一试剂厂家、统一货号，三是利用诺维信标准对本公司的标准进行标定。

另外，选择与样品浓度要求相适应的天平，应该尽可能使用高精度的天平，这样才能把由于天平使用带来的称量操作误差降至最低。

3.2  标准曲线的配制不规范带来的误差

标准配制可以3～7个梯度不等，至少不应低于3个梯度。样品检测结果必须在曲线范围内，可根据样品含量不同，调整标准浓度。

3.3  酒精发酵液样品预处理带来的误差

樣品预处理同样重要，不同的预处理方法可能造成检测结果不同。如离心程度不同，造成的杂质含量不同，进而样品中物质的含量不同，所以待测定溶液不具有可比性。挥发性的物质的要注意保存和转移，如会造成乙醇含量检测不准确。

3.4  较好的分离度是色谱分离的保障

实际应用中色谱分离度对分析结果的影响可概括为三个主要方面：

（1）一些微量杂质和主蜂的分离度太小，杂质峰包含在主峰中或只表现为小的肩蜂，积分仪无法，识别该杂质蜂而将其并入主峰[6]。

（2）色谱峰的分离度不好，使得数据处理机无法正确判断色谱峰的基线，导致积分结果失真。

（3）重叠峰影响峰面积测定的结果。

麦芽三糖、果糖检测误差较大，误差主要来源是色谱柱塌陷造成分离度较差、积分误差大，见表3、图1-2。

3.5  增加平行测定的次数

增加测定次数可以减少随机误差。在一般分析工作中，测定次数为2～4次。减少偶然误差，基本上可以得到比较准确的分析结果。

3.6  积分不一致带来的误差

数据处理机参数对实验结果的影响，对色谱结果的处理通常借助于数据处理机来完成，数据处理机一般都设有多种积分方式供使用者选择。对没达到基线分离的色谱峰，选择不同的积分方式将得到不同的结果， 见图3。

色谱峰自动积分相差较大，手动积分应尽量选择相同的积分参数（最小峰宽、峰面积、积分方式），减少人为误差。因为选用不同数值，将影响色谱峰起止点的识别，得到不同的峰面积，进而影响到所得定量结果的准确程度。一定要保证处理同一系列数据（各个标样数据和未知样品数据）时，这两个参数值是一致的。

3.7  第二次对标情况

从结果看出，经过误差分析和统一分析过程，结果误差在允许范围之内，见表4。

4  结 论

酒精发酵液中糖谱的液相对标分析，结果表明，样品处理方法、色谱柱的分离效果、仪器分析参数的选择、标准溶液的配制、色谱图的积分处理等是误差的来源，将这些细节问题进行明确化，是获得一致数据的基础。

通过对标分析，使酒精发酵液质量与发酵水平可以与行业、甚至国际生产水平进行对比，为生产技术改进等提供准确的数据支持。

参考文献：

[1]范正苑.色谱定性与定量[M].北京：化学工业出版社，2000.

[2]杨艳， 陈旭冰， 陈光勇，刘光明.超高效液相色谱在中药研究中的应用[J].云南中医中药杂志， 2012， 33 （6） ：70-72.

[3]刘文信.HPLC在酒精发酵醪液检测中的应用[J].化学工程师，2013（2）：28-29.

[4]郭福阳，刘辉，从志会，王泽兴.高效液相色谱法检测白酒基酒中的乳酸[J].当代化工， 2015，44（12）： 2923-2925.

[5]黄万顺.分析仪器及器皿、试剂和操作规程对容量分析结果误差的影响[J].科技创新与应用， 2017（15）： 291.

[6]胡昌勤，金少鸿. 高效液相色谱中的误差分析[J].中国抗生素杂志，1993，18（4）：312-318.