天麻普通粉、破壁粉、冻干粉对戊四唑诱导惊厥大鼠海马组织GABA-T mRNA及蛋白表达的影响

陈露露 柴艺汇 田兴中 刘春艳 谢宇 周雯 牛建均 张丽艳

【摘 要】 目的：研究天麻普通粉、破壁粉、凍干粉对戊四唑诱导惊厥大鼠海马组织γ-氨基丁酸转氨酶（7-Aminobutyrate transaminase，GABA-T） mRNA及蛋白表达的影响，初步探讨天麻破壁粉、冻干粉对神经细胞的保护作用机制，并对3种不同加工工艺的天麻的效应差异性进行对比，为合理使用不同加工工艺的天麻提供实验参考。方法：利用戊四唑惊厥模型，将SD大鼠随机分为正常组，模型组，阳性对照组，天麻（普通粉、破壁粉、冻干粉）低、中、高剂量组（0.5、1.0、2.0 g/kg）。用荧光定量聚合酶链式反应法（Real-time PCR）检测不同工艺的天麻对戊四唑诱导惊厥大鼠海马组织GABA-T mRNA表达的情况;用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测不同工艺的天麻对戊四唑诱导惊厥大鼠海马组织GABA-T蛋白表达情况。结果：RT-PCR和WB检测显示，模型组大鼠海马组织GABA-T mRNA和蛋白相对表达量显著升高（P<0.05）;与模型组比较，阳性对照组和天麻各组均可显著降低大鼠海马组织GABA-T mRNA和蛋白相对表达量（P<0.05），天麻冻干粉和破壁粉抗惊厥效果不同程度优于天麻普通粉，其中冻干粉的效果优于破壁粉，破壁粉的效果优于普通粉，且在一定范围内呈量效关系。结论：天麻冻干粉和破壁粉对戊四唑诱导惊厥大鼠的神经保护作用效果强于普通粉，与加工方式有关，且呈量效关系，其作用机制可能与大鼠海马组织GABA-T mRNA及蛋白表达水平有关。

【关键词】 天麻;破壁粉;冻干粉;抗惊厥;GABA-T

【中图分类号】R285.5   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2019）16-0019-05

Abstract：Objective The effects of Tianma ordinary powder， broken wall powder and freeze-dried powder on the expression of GABA-T mRNA and protein in hippocampus of rats induced by pentylenetetrazol were studied. The protective mechanism of Tianma broken wall powder and freeze-dried powder on nerve cells was discussed. The effect difference of the gastrodia elata is compared， and an experimental reference is provided for the reasonable use of different processing techniques. Provide experimental reference for Tian-Ma for rational of differentin processing techniques. Methods The pentylenetetrazol-induced convulsion model was established and the SD rats were randomly divided into normal group， model group， positive control group， Tianma ordinary powder， broken wall powder， freeze-dried powder low， medium and high dose group （0.5， 1.0， 2.0 g/kg）. Real-time PCR was used to detect the expression of GABA-T mRNA in different hippocampus induced by pentylenetetrazol-induced convulsion rats. Detection of GABA-T protein expression in hippocampus of pentylenetetrazol-induced convulsion rats by WB with different techniques. Results RT-PCR and WB showed that the expression of GABA-T mRNA and protein in the hippocampus of the model group was significantly increased （P<0.05）. Compared with the model group， the positive control group and the gastrodia elata group were significant. The relative expression of GABA-T mRNA and protein in hippocampus of rats was decreased （P<0.05）. The anticonvulsant effect of Tianma freeze-dried powder and wall-breaking powder was better than that of Tianma ordinary powder. The effect of freeze-dried powder was better than that of wall-breaking powder. The effect of wall-breaking powder is better than ordinary powder， and it is dose-effect relationship within a certain range. Conclusion The effects of Tianma freeze-driedpowder and wall-breaking powder on the neuroprotective effect of pentylenetetrazol-induced convulsion rats are stronger than those in common powders， which are related to the processing method and have ahippocampus of rats.

Keywords：Tianma;Broken Wall Powder; Freeze-dried Powder;Anticonvulsant;GABA-T

惊厥是由多种原因引起的中枢神经系统过度兴奋，导致神经细胞异常运动，临床表现为对称性、全身性和阵发性的肌肉抽动，伴有眼球上翻、意识障碍，主要好发于儿童的一类神经疾病[1]。惊厥发病机制复杂，通常以神经递质之间的平衡紊乱为主。神经递质包括抑制性和兴奋性神经递质，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是抑制性神经递质，在抗惊厥方面发挥重要作用[2]。GABA受γ-氨基丁酸转氨梅（γ-aminobutyrate transaminase，GABA-T）催化降解，GABA-T活性增强已成为惊厥发病的一个重要因素[3-4]。天麻化学成分含有天麻素、天麻甘元、香荚兰醇多糖等，其活性成分主要以酚类及多糖为主，具有抗惊厥、保护神经细胞、镇痛、镇静、抗衰老等药理作用[5]。破壁粉碎技术是将传统饮片加工粉碎至D90<45μm的粉体，无需添加任何辅料制成中药破壁饮片，提高生物利用度的一种技术[6]。冻干技术是将中药材在真空状态下冷冻，通过水的升华除去水分，已被国家列入“21世纪中医药现代化发展战略”之一的一种干燥技术[7]。研究以大鼠为对象，探讨天麻（普通粉、破壁粉、冻干粉）对戊四唑诱导惊厥大鼠海马组织GABA-T mRNA及蛋白表达的影响，初步探讨不同工艺的天麻治疗惊厥的疗效和作用机制，为后期临床和实验研究使用天麻破壁粉和冻干粉提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 动物 72只清洁级SD大鼠，体重为（200±20）g，购自于庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司，动物许可证号：SCXK（军）2012-0011。

1.2 药物 天麻来源为自采，经贵州中医药大学植物栽培教研室魏升华教授鉴定为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎。普通粉：60℃中烘干，研磨粉碎后过6号筛制成;破壁粉：60℃中烘干，应用破壁粉碎技术加工、干压制成粉粒;冻干粉：真空干燥机将切制、灭菌的新鲜天麻冻干，小钢磨粉碎后，最后过药典6号筛筛选制成。

1.3 试剂 丙戊酸钠（批号：8HG0385，赛诺菲制药有限公司）;戊四唑 （批号：#L16185，深圳市华宇能通讯科技有限公司）;TRNzol总RNA提取试剂（批号：DP405-02，天根生化科技（北京）有限公司）;DL2000 DNA Marker（批号：3427Q，宝日医生物技术有限公司）;Ultrapure RNA Kit（批号：CW0581M，北京康为世纪生物科技有限公司）;HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit（批号：Q221-01，南京诺唯赞生物科技有限公司）;一步法快速WB（HRP）试剂盒（兔）（批号：CW02029）、一步法快速WB（HRP）试剂盒（鼠）（批号：CW02030）、BCA蛋白定量试剂盒（批号：CW0014）均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.4 仪器 Step One Plus型荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）;C2500型低温离心机（湖南湘仪实验仪器厂）;ZS-2型板式酶标仪（北京新风机电有限公司）;164-5050型电泳仪（伯乐生命医学产品有限公司）;Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System型蛋白电泳槽（伯乐生命医学产品有限公司）;Mini Trans-Blot型蛋白转印系统（伯乐生命医学产品有限公司）;Tanon 1600型凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 分组 72只健康成年SD大鼠，将大鼠适应性养7d，随机分为12组，每组6只，然后称重、标记。分组：正常组，模型组（戊四唑），阳性对照组（丙戊酸钠）组，天麻普通粉低、中、高剂量组（0.5g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg），天麻破壁粉低、中、高剂量组（0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg），天麻冻干粉低、中、高剂量组（0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg）。

2.2 造模及给药 正常对照组用生理盐水灌胃（4 mL/kg）;模型组用戊四唑腹腔内注射（0.08g/kg）;阳性对照组戊四唑腹腔内注射 （0.08 g/kg），再给予丙戊酸钠灌胃（0.12g/kg），持续10d;药物组戊四唑腹腔内注射 （0.08 g/kg），分别给予天麻（普通粉、破壁粉、冻干粉）低、中、高剂量组（0.5g/kg、1 g/kg、2 g/kg）灌胃，使药物均匀溶解，连续给药10d，并给予适宜环境生长，自由进水进食。在给药之后把大鼠单独放在鼠笼里并观察大鼠30 min的形力學改变，惊厥诊断参照Racine标准记录发作等级，选择发作等级大于Ⅳ的进入下一步实验。[8]

2.3 检测指标

2.3.1 对戊四唑诱导惊厥大鼠GABA-T mRNA表达量的影响 按照超纯RNA试剂盒说明从大鼠海马组织制备总RNA，分光光度计测定总RNA浓度和纯度，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，按cDNA反转录试剂盒说明进行逆转录。PCR扩增条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火40s，60℃延伸1min，循环次数40个。目的基因作为引物和以GAPDH作为内参基因，引物列为GAPDH，上游引物序列5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′，下游引物序列5′-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3′，扩增产物长度270 bp;GABA-T上游引物序列5′-CTTTCTGTTCTCAACTC-3′，下游引物序列5′-TGAATACTCTGCCCTGCTCT-3′，扩增产物长度138 bp。PCR实验需重复3次，每次3个复孔，根据Real-time PCR原始数据Ct值，并计算相对定量值。

2.3.2 对戊四唑诱导惊厥大鼠海马组织样本中GABA-T蛋白表达量的影响 称取适量大鼠海马组织加入适量RIPA（细胞裂解液）裂解液匀浆后，10000 rpm离心20 min，然后取上清液，按BCA 试剂盒测定蛋白浓度。在凝胶电泳槽中加入制备好的蛋白样品，转膜，取膜。封闭液封闭后，使一抗与二抗充分混匀，于室温条件下孵育5 min，加入一步法抗体稀释液（一抗GABA-T浓度（1∶ 1000）、二抗GABA-T浓度（1∶ 200），一抗内参β-actin浓度（1∶ 5000）、二抗内参β-actin浓度（1∶ 200）。混匀，放入PVDF（聚偏氟乙烯）膜，ECL（电致化学发光）化学发光试剂显色，开始曝光。扫描胶片并保存，凝胶成像系统对各组数据进行分析。目的蛋白表达量与同一样本内参表达量之比可以计算出目的蛋白相对表达量。

2.4 统计学分析 数据采用SPSS 22.0统计软件统计，用（x±s）表示，采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 戊四唑诱导惊厥大鼠海马组织GABA-T mRNA表达量的变化 与正常组比较，模型组GABA-T mRNA相对表达量显著上升（P<0.05）;与模型组比较，阳性药对照组和不同工艺的天麻组均可显著降低GABA-T mRNA相对表达量（P<0.05），在一定范围内呈量效关系，且天麻冻干粉高剂量组与阳性对照组的GABA-T mRNA表达无明显差异（P>0.05）。天麻冻干粉中剂量组对GABA-T mRNA表达的抑制作用高于天麻破壁粉高剂量组（P<0.05）。见表1。

3.2 戊四唑诱导惊厥大鼠海马组织GABA-T蛋白表达量的变化 与正常组比较，模型组GABA-T蛋白相对表达量显著提高（P<0.05）;与模型组比较，阳性对照组和不同工艺的天麻组均可不同程度降低GABA-T蛋白相对表达量（P<0.05）。相同剂量下，天麻因加工工艺不同对大鼠海马组织GABA-T蛋白表达量也不同，整体蛋白表达量呈现：普通粉>破壁粉>冻干粉。见图1、2。

4 讨论

惊厥是以神经细胞反复放电、大脑功能暂时性失常为特征的神经系统疾病。广泛分布于脑内的GABA作为抑制性神经递质在抗惊厥中发挥着重要作用，GABA经谷氨酸合成，通过GABA-T催化生成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脱羧酶的催化下生成琥珀酸，进入三羧酸循环，GABA-T是GABA的代谢过程中的关键酶[9]。研究表明，GABA-T抑制剂可以提高机体脑内的GABA浓度，且这类抑制剂对惊厥机体大脑有高度选择性作用，所以GABA-T可以作为治疗惊厥的一个重要靶点[10]。目前惊厥的治疗集中于对症治疗和控制疗法，难于对因治疗和根治，临床疗效较差，西医药物治疗一般使用苯二氮卓类、苯巴比妥类等药物，但不良反应较多。天麻具有祛风止痉、平肝熄风等功效，其在改善惊厥的临床症状、恢复神经细胞功能、延长发作间歇期、减少复发等方面占有独特优势[11]。抗痫胶囊（主要药物含有天麻）可以明显降低GABA-T的活性而达到治疗惊厥的作用[12]。

天麻破壁粉是利用现代超微粉碎技术将传统饮片粉碎成D90<45 μm的粉体，以不同浓度的乙醇或水作为黏合剂制成30～100目的一种新型饮片。中药饮片发挥治疗作用的基础主要是药物中的有效活性成分，但大多药物的活性成分在细胞内部。当天麻经破壁技术加工后，其细胞壁被打破，提高天麻在体内的释放速度和吸收程度;天麻粒径减小、表面积增大，提高有效成分的溶出，因此与传统饮片相比更利于细胞内的有效成分的释放，从而大大提高了药物活性成分的溶出率 [13]。邓银爱等[14]研究在大鼠体内药代动力学变化，黄芪破壁饮片的生物利用度较黄芪传统饮片高。林伟波[15]研究参芪固本方对大肠癌化疗后造血系统改善作用，发现同等剂量时破壁饮片疗效明显优于传统饮片。

天麻冻干粉是将其在低温条件下经现代提取工艺制备而成的新剂型，其制备过程中隔绝空气。因此冻干技术有效地抑制了热敏性物质发生生物、化学或物理变化，保存了天麻的活性物质，使天麻成分稳定性增高，不易发生化学变质，改善了鲜天麻不易保存的缺点[16]。研究表明，新鲜天麻经过真空冷冻干燥工艺研究，其天麻素保留率可达0.67%。陈艳芬等[17]在研究决明子配方颗粒的药效学，结果显示决明子配方颗粒药效总体优于传统水煎液，其中以冷冻颗粒药效最好。张兴盈[18]在不同加工工艺的云当归抗凝血作用比较中，发现真空干燥成的冻干云当归抗凝血作用比其它加工工艺（鼓风干燥、微波干燥、自然晒干）的云当归效果好，同等剂量时其利用率提高。

研究发现，天麻冻干粉中劑量组对GABA-T mRNA表达的抑制作用高于天麻破壁粉高剂量组（P<0.05）;同等剂量下，天麻破壁粉对GABA-T mRNA及蛋白表达的抑制作用高于天麻普通粉。因此，天麻破壁粉、冻干粉均能提高对惊厥大鼠海马组织神经细胞的保护作用，且整体效果呈现冻干粉的效果优于破壁粉，破壁粉的效果优于普通粉，其作用机制可能是不同加工工艺的天麻调节GABA-T mRNA及蛋白表达的差异与天麻粉碎粒径大小和干燥方式有关，本研究为天麻冻干粉、破壁粉的临床应用提供理论和实验基础。但不同干燥和粉碎技术对天麻抗惊厥有效成分的差异性，有待进一步研究证实明确。

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（收稿日期：2019-06-03 编辑：陶希睿）