血浆miR-192、miR-29c水平对2型糖尿病肾病诊断的临床意义

何爽 黄萍 范明娟

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是临床常见疾病，其中2型糖尿病是主要病理类型，而糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病的主要并发症之一，DN早期症状较为隐匿，目前尚缺乏有效诊断指标［1-3］。因而积极寻找分子标志物对2型糖尿病肾病的诊断及改善患者预后具有重要临床意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是一种内源性非编码小RNA分子，并可通过调控下游靶基因表达而参与多种生理病理过程，研究表明部分miRNA异常表达与2型糖尿病肾病发生过程密切相关，并可能作为诊断早期糖尿病肾病的分子标志物［4］。但miRNA诊断2型糖尿病肾病存在一定假阳性或假阴性，因而需积极探寻miRNA分子并分析其对2型糖尿病肾病的诊断价值。相关报道指出微小 RNA-192（microRNA-192，miR-192）在 DN患者血清中呈低表达，并可能调控DN发生发展过程［5］。研究表明微小RNA-29c（microRNA-29c，miR-29c）可通过调控靶基因Sprouty homolog 1表达而促进糖尿病肾病发展，抑制miR-29c的表达可减缓糖尿病肾病的进展［6］。但miR-192与miR-29c对2型糖尿病肾病的诊断价值尚未可知。尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）可参与多种肾脏疾病的发生及发展过程，并可作为反映急性肾损伤的重要指标［7-8］。本研究主要探讨血浆 miR-192、miR-29c与NGAL的相关性，分析血浆miR-192与miR-29c联合检测对2型糖尿病肾病的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2017年12月至2018年12月本院收治的166例2型糖尿病患者为研究对象，所有患者均符合糖尿病诊断标准［9］。Ⅱ型糖尿病患者符合下列任何一项者：①大量白蛋白尿；②糖尿病视网膜病变伴微量蛋白尿即诊断为Ⅱ型糖尿病肾病［10］。其中DM组患者尿微量清蛋白/Crea低于30 mg/gCrea，DN组患者尿微量清蛋白/Crea处于30～300 mg/gCrea之间［11］。同时以本院同时期健康体检人群60例为NC组。DM组患者年龄为68～75岁，平均年龄为（71.35±6.13）岁；DN组患者年龄为62～76岁，平均年龄为（72.35±4.49）岁；正常组年龄为66～76岁，平均年龄为（70.32±5.31）岁。所有患者知情且签署同意书。排除标准：合并内分泌、心血管等疾病患者；原发性肾病、肾动脉狭窄等疾病患者；心脏与肝脏等全身疾病引发的肾脏疾病患者。各组研究对象年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 采集样本

所有研究对象均于入组后空腹12 h，取清晨静脉血5 mL置于EDTA抗凝管，4℃条件下，2 500 r/min转速离心10 min，分离血浆，吸取血浆置于1.5 mL EP管内，置于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.2.2 主要试剂与仪器

miRNAcute miRNA提取分离试剂盒、miRNAcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、荧光定量检测试剂盒均购自广州真知生物有限公司；尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）检测试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司。ABI 7500型荧光定量PCR仪购自北京拓普塞斯生物技术有限公司。

1.2.3 时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Realtime PCR，qRT-PCR）检测血浆 miR-192、miR-29c的表达水平

采用miRNAcute miRNA提取分离试剂盒分离并提取RNA，按照miRNAcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行反转录合成cDNA，参照荧光定量检测试剂盒进行荧光定量检测，其中U6为内参，正向引物为5′-ATTGGAACGATACAGAGAA-GATT-3′，反向引物为：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；miR-192 正向引物为 5′-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3′，反向引物为：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-29c正 向 引 物 为5′-GTAGCACCATTTGAAATCAG-3′，反向引物为：5′-TTGGCACTAGCACATT-3′。反应体系：cDNA 2.0 μL，Primer 1.0 μL，RNase H2O 7 μL，SYBR Primix Ex TaqTM10 μL。反应条件：95℃预变性 2 min，95℃变性 15 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共循环 40 次。采用 2-ΔΔCt法计算 miR-192、miR-29c的相对表达量。

1.2.4 临床指标

所有研究对象均留取清晨中段尿5 mL，室温条件下，3 000 r/min转速离心10 min，吸取上清置于EP管内，-80℃条件下冻存。采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 结果判定

根据糖尿病肾病临床诊断标准，2型糖尿病患者糖尿病无肾损害组（DM组）86例与糖尿病肾病组（DN组）80例。采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）分析血浆miR-192、miR-29c表达对2型糖尿病肾病的诊断价值，根据临床检测结果比较分析血浆miR-192、miR-29c诊断2型糖尿病肾病的效能分析。

1.3 统计学处理

采用统计学软件SPSS 21.0进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；Pearson法进行相关性分析；ROC分析血浆miR-192、miR-29c表达对2型糖尿病肾病的诊断价值；计数资料采用χ2检验，各组数据均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般资料比较

与正常组比较，DM组与DN组患者空腹血糖均显著升高（P＜0.05），DN组显著高于DM组（P＜0.05）；相较于正常组，DM组与DN组患者尿NGAL均显著升高（P＜0.05），DN组显著高于DM组（P＜0.05），而各组研究对象性别、年龄、体质指数等比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of general data of each group（±s）

表1 各组一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of general data of each group（±s）

与NC组相比，*P＜0.05；与DM组相比，#P＜0.05。

组别NC组DM组DN组F/χ2 P值n 60 86 80男/女38/22 53/33 50/30 0.044 0.978年龄（岁）61.32±8.31 61.35±8.13 62.35±6.49 0.454 0.636空腹血糖（mmol/L）4.32±0.32 7.96±1.59*8.52±1.52*#49.238 0.000尿NGAL（μg/L）8.31±1.21 16.58±3.12*39.57±6.58*#988.014 0.000体质指数（kg/m2）26.58±3.25 26.45±3.21 26.47±3.35 0.031 0.970

2.2 各组血浆miR-192、miR-29c表达水平比较

与NC组相比，DM组与DN组患者血浆miR-192的表达水平均显著降低（P＜0.05），DN组显著低于DM组（P＜0.05）；相对于NC组，DM组与DN组患者血浆miR-29c的表达水平显著升高（P＜0.05），DN组显著高于DM组（P＜0.05），见表2。

2.3 血浆miR-192、miR-29c表达与DN患者NGAL的相关性分析

采用Pearson法分析DN患者血浆miR-192、miR-29c表达水平与尿NGAL的相关性，结果显示，miR-192与尿NGAL呈负相关（r=-0.338，P=0.002），miR-29c与尿NGAL呈正相关（r=0.516，P=0.000），见图1。

表2 各组血浆miR-192、miR-29c表达水平比较（±s）Table 2 Comparison of plasma miR-192 and miR-29c expression levels in each group（±s）

表2 各组血浆miR-192、miR-29c表达水平比较（±s）Table 2 Comparison of plasma miR-192 and miR-29c expression levels in each group（±s）

组别NC组DM组DN组F值P值n 60 86 80 miR-192 1.00±0.09 0.62±0.15*0.31±0.02*#751.971＜0.001 miR-29c 1.01±0.13 2.16±0.24*3.22±0.57*#597.004＜0.001

2.4 血浆miR-192、miR-29c对2型糖尿病肾病的诊断价值

图1 血浆miR-192、miR-29c表达与DN患者NGAL的相关性分析Figure 1 Correlation analysis between plasma miR-192 and miR-29c expression and NGAL in patients with DN

ROC分析血浆miR-192对Ⅱ型糖尿病肾病的诊断价值，结果显示miR-192诊断2型糖尿病肾病的灵敏度为52.50%，特异度为75.58%，AUC为0.679，95%CI：0.602～0.749，截断值为0.40，见图2A。ROC分析血浆miR-29c对Ⅱ型糖尿病肾病的诊断价值，结果显示miR-29c诊断2型糖尿病肾病的灵敏度为50.00%，特异度为86.05%，AUC为0.796，95%CI：0.726～0.854，截断值为2.94，见图2B。

图2 ROC分析血浆miR-192、miR-29c对Ⅱ型糖尿病肾病的诊断价值Figure 2 ROC analysis of the value of plasma miR-192 and miR-29c in the diagnosis of type 2 diabetic nephropathy

2.5 联合检测对2型糖尿病肾病的诊断价值

联合检测时，诊断灵敏度为97.50%，特异度为95.34%，准确度为96.39%，见表3。miR-29c对2型糖尿病肾病的诊断特异度高于miR-192，联合检测时灵敏度与准确度均高于单项检测（P＜0.05），见表3、表4。

3 讨论

2型糖尿病是一种内分泌代谢性疾病，机体长时间处于高血糖状态可促进内皮细胞释放内皮血管活性物质从而促使肾小球硬化导致糖尿病肾病的发生［12］。糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症，临床主要通过检测微量尿蛋白诊断糖尿病肾病，由于微量尿蛋白受多种因素的影响导致其对肾损伤程度的诊断缺乏特异性［13］。因而寻找敏感、特异且无创性的指标诊断2型糖尿病肾病具有重要意义。研究表明miRNA在糖尿病患者血清中异常表达并可能作为诊断糖尿病肾病的有效指标［14］。因此本研究积极探寻与2型糖尿病肾病发生发展相关的miRNA，进一步分析其对2型糖尿病肾病的诊断价值。

表3 miR-29c和miR-192联合检测对Ⅱ型糖尿病肾病的诊断价值Table 3 Diagnostic value of combined detection of miR-29c and miR-192 in type 2 diabetic nephropathy

表4 miR-29c和miR-192联合检测与单项检测对Ⅱ型糖尿病肾病的诊断价值分析Table 4 Diagnostic value of combined detection and single detection of miR-29c and miR-192 in type 2 diabetic nephropathy

miR-192在成人心脏手术后急性肾损伤血浆中的表达水平异常，并可作为急性肾损伤的早期诊断标志物［15］。miR-192在2型糖尿病肾病患者中的表达水平降低且伴随尿白蛋白肌酐比值（UACR）的降低，miR-192低表达与肾脏纤维化密切相关［16］。研究表明miR-192通过靶向早期生长反应因子 1（Egr1）的表达影响 DN 的进展［17］。本研究结果显示2型糖尿病肾病患者血浆中miR-192的表达水平显著降低，提示miR-192表达下调可能参与2型糖尿病肾病发生发展过程。本研究结果显示2型糖尿病患者尿NGAL水平显著高于正常组，而2型糖尿病肾病患者尿NGAL水平显著高于DM组，进一步分析发现2型糖尿病肾病患者中miR-192表达与尿NGAL水平呈负相关，说明NGAL可反应2型糖尿病肾病患者肾功能损伤状况，肾小管损害可引起血浆miR-192的低表达。提示miR-192表达下调可能促进疾病进展并损害肾小球及内皮细胞功能。沉默miR-29c可能通过AMPK/mTOR信号抑制糖尿病肾病肾纤维化，并可能作为治疗糖尿病肾病肾纤维化的有效靶点［18］。miR-29c在狼疮性肾炎患者中呈高表达，还可作为狼疮性肾炎早期肾纤维化的预测因子［19］。研究表明miR-29c还可作为诊断HTLV-1感染的新型潜在生物标志物［20］。本研究结果显示2型糖尿病患者血浆中miR-29c的表达水平显著升高，且DN组显著高于DM组，提示随着miR-29c表达水平的升高可促进2型糖尿病肾病的发生及发展。

基于以上研究结果，本研究结果显示2型糖尿病肾病患者中miR-29c与NGAL水平呈正相关，提示miR-29c与NGAL在2型糖尿病肾病发生发展过程中可能存在一定正向调控作用。目前关于miRNA与2型糖尿病肾病诊断的研究较多，但关于miR-29c、miR-192联合检测对2型糖尿病肾病的诊断价值尚未见报道，本研究采用ROC分析血浆miR-192、miR-29c表达对2型糖尿病肾病的诊断价值，结果显示miR-192对2型糖尿病肾病的诊断灵敏度与特异度较低，而miR-29c对2型糖尿病肾病的诊断灵敏度与特异度高于miR-192，进一步采用联合检测，结果显示联合检测显著高于单项检测。提示联合血浆miR-192、miR-29c表达水平检测可显著提高2型糖尿病肾病的诊断效率及准确率。

综上所述，血浆miR-192、miR-29c联合检测2型糖尿病肾病具有较高的诊断效能，可能成为2型糖尿病肾病的诊断指标。但血浆miR-192、miR-29c与微量尿蛋白指标的比较仍需进一步研究，关于miR-192、miR-29c与NGAL在2型糖尿病肾病发生发展过程中的作用机制仍需深入研究。