纳他霉素对采后柑桔病菌抑菌效果的研究

2019-11-30黄文彬

现代园艺 2019年23期

黄文彬

（江苏联合职业技术学院盐城生物工程分院，江苏盐城 224001）

柑桔青霉病和绿霉病是造成柑桔果实采后贮藏腐烂的主要病害，是由意大利青霉菌和指状青霉菌侵染柑桔而引起的。每年由于感染以上2 种病菌而损失的柑桔果实达到30%～50%[1]。目前生产上广泛使用咪鲜胺、甲基托布津、多菌灵等化学杀菌剂进行防治，由于化学保鲜剂的长期大量使用，造成药物残留，对人体健康以及柑桔果实的品质造成严重的影响。纳他霉素是一种高效、广谱的真菌抑制剂，主要应用于肉类、饮料、乳制品等食品中，能较好地抑制霉菌、酵母菌生长。目前将纳他霉素应用在水果保鲜上的报道还很少，在柑桔[2]、草莓[3]、葡萄[4]、苹果[5]上面有些初步研究。本试验以引起柑桔采后青绿霉病的意大利青霉和指状青霉为材料，研究不同浓度纳他霉素对2 种青霉菌的抑制作用及毒力方程，确定最低抑菌浓度，旨在为研究纳他霉素在果蔬保鲜中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种为意大利青霉（Penicillium italicum）、指状青霉（P.digitatum），均购于中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC），纳他霉素（Natamycin）购于兰州伟日生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

生化培养箱，高压灭菌锅，超净工作台，电子天平，移液枪（0～1000μL）。

1.3 试验方法

1.3.1 不同浓度纳他霉素对青霉菌的抑制效果评价。将纳他霉素配制成100、150、200、300、400、500、600、700μg/mL 的浓度梯度。用接种环分别挑取少量培养3d 的意大利青霉和指状青霉菌于装玻璃珠的无菌生理盐水三角瓶内，振荡10min 左右，制成均匀的菌悬浮液。血球计数板计数，使其含孢子为106～107CFU/mL左右，用移液枪向凝固的PDA 平板上加0.1mL 菌悬液，无菌三角玻璃刮铲涂布均匀。镊子夹无菌牛津杯，放置于菌液平板表面，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。用移液枪向牛津杯加0.2mL 不同浓度的纳他霉素，勿使外溢。至26℃培养箱中培养，观察抑菌效果，测量抑菌圈直径。

1.3.2 纳他霉素对青霉菌的最低抑制浓度（MIC）。将纳他霉素用2%冰醋酸配制成浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL。于含不同浓度药液的试管中，各加入测试菌0.2mL，充分混匀，将上述试管置于28℃的恒温箱中培养24h。取出试管，充分振荡，并对各试管进行逐个检查，用肉眼观察其浑浊度。

1.3.3 菌悬液及菌饼的制备[6]。将供试菌于28℃马铃薯琼脂培养基上活化3d，用无菌水配制成106～107CFU/mL 的霉菌孢子悬浮液。取菌悬液0.2mL 接入已凝固的PDA 培养基上，涂布均匀。放入26℃培养箱中培养3d，用打孔器在菌落边缘打出6mm 直径的菌饼，待用。

1.3.4 纳他霉素对青霉菌菌丝的生长抑制作用。采用室内生长速率法[7]，测定纳他霉素对指状青霉菌和意大利青霉菌的毒力大小。

2 结果与分析

2.1 不同浓度纳他霉素对青霉菌抑制效果评价

由表1 可知，不同浓度纳他霉素对柑桔青霉均有良好的抑制效果，随着浓度的不断提高，抑菌圈直径也随之增大，500μg/mL 以后随着浓度的增加，抑制效果差异不显著，而且经过试验，浓度600μg/mL 和700μg/mL 浸泡脐橙时，表面会残留有白色的药斑，影响果实外观，综合考虑成本和抑制效果，推荐生产实践的浓度为500μg/mL 为佳。

表1 纳他霉素对意大利青霉和指状青霉的抑制效果（96h）

2.2 纳他霉素对青霉的最低抑制浓度（MIC）

表2 可知，纳他霉素对意大利青霉和指状青霉都有极强的抑制作用，随着浓度的增加，其抑菌作用越明显，两者的最低抑制浓度相同，为6μg/mL。

2.3 纳他霉素对柑桔青霉菌菌丝生长的抑制作用

表2 纳他霉素对意大利青霉和指状青霉的最低抑制浓度（72h）

采用室内毒力测定法，在PDA 培养基上测定纳他霉素对柑桔青霉菌菌丝的抑制作用，获得不同浓度药剂处理对菌落生长抑制作用数据，得出以各药剂浓度对数值为X，抑菌率几率值为Y 的毒力回归方程和EC50，其结果见表3，纳他霉素对意大利青霉菌的毒力作用较强，EC50 为0.6287μg/mL，对指状青霉的毒力作用稍弱，EC50 为3.5319μg/mL。