基于SCSA乌苏里拟鲿精子保存液的使用效果＊

赵道全，武慧慧，陈军平，李先明，谢国强，胡亚东，李治勋



基于SCSA乌苏里拟鲿精子保存液的使用效果＊

赵道全，武慧慧，陈军平，李先明，谢国强，胡亚东，李治勋

（河南省水产科学研究院，河南 郑州 450044）

鱼类精子质量是影响人工繁殖的重要因素，雌雄性成熟不同步或需杀雄鱼取精的鱼类，为了保障其规模化繁殖，采用精子保存液将精子暂存起来，繁殖时随用随取，因此，精子保存液的保存效果又直接影响着人工繁殖。如何确定保存液中精子的质量，可以用镜检宏观判断，但这样并不精准。SCSA通过量化判断出保存液中精子的质量，从而为繁殖提供保障。自行研制的hnscz拟鲿精子保存液经SCSA分析测试，其实际应用优于购买的hanks精子保存液。测试结果为≤0.15，精子活力旺盛，使用效果明显。

SCSA；精子保存液；DNA断裂指数；精子活力

乌苏里拟鲿（Pseudobagrus ussuriensis）隶属于鲇形目鲿科鱼类，生活于江河底层，以底栖动物为食，如蜉蝣类、毛翅幼虫等，幼鱼以摇蚊幼虫为食。

该鱼分布在我国各大水系，但总体资源量有限，属稀有物种。3 龄达性成熟，产卵期在5月中旬至7月末，自然产卵量很少。

人工繁殖需杀雄鱼取精，规模化繁殖需提前用保存液保存备用，从而提高效率和效果。

精子染色质结构分析（SCSA）是检测精子DNA完整性的一种方法，其原理是正常精子DNA呈双链结构，而受损的精子染色质结构松散，DNA在酸的作用下变性成单链。利用吖啶橙（AO）与双链DNA结合发绿色荧光，而与单链DNA结合发红色荧光的特性，AO染色后的精子悬液利用流式细胞仪分析可判断精子质量[1]。

1 材料和方法

试剂：吖啶橙（AO）染液、盐酸、hanks精子保存液（商品购买）、hnscz精子保存液（自配优选）。

样本：取精子研磨[2]，分别取hnscz和hanks精子保存液各8 mL，显微镜观察后稀释精液，根据实验设计时间段，提前按4 h、96 h、144 h稀释好后分别用试管标号放置于4 ℃冰箱冷藏保存待用[3-5]。

分别取hnscz和hanks保存的4 h、96 h、144 h精子各30 μL；+ 酸吸液80 μL（反应30 s）；+ AO染色液100 μL（反应3 min）；上机（Cyto FLEX流式细胞仪）检测。

实际人工授精验证分别取不同保存时间的精子与人工催产后挤出的乌苏里拟鲿卵授精[6]，把授精卵分别按标号放入孵化框，在孵化槽中孵化5 h统计受精率[7]。

2 结果与分析

2.1 断裂指数分析

在FSC/SSC图上圈出精子细胞，设门至FL1（FITC）/FL3（ECD）散点图上进行分析。DNA完整性好的精子主要发绿色荧光（P2 门）；DNA完整性差的精子主要发红色荧光（P4 门）。通过公式计算DNA断裂指数来评价精子DNA质量，=red/（red + green）.

从实验测试数据得出以下结果。

Hnscz：

1=6.37÷（39.03+6.37）=0.14.

2=11.28÷（40.65+11.28）=0.21.

3=9.48÷（23.23+9.48）=0.29.

Hanks：

1=9.44÷（32.10+9.44）=0.23.

2=8.29÷（17.18+8.29）=0.32.

3=18.85÷（38.54+18.85）=0.32.

从以上断裂指数结果来看，我们配置的hnscz精子保存液保存的精子比购买的hanks精子保存液保存的精子的断裂指数小，即hnscz1＜hanks1；hnscz2＜hanks2；hnscz3＜hanks3，这说明自己研制的精子保存液hnscz优于商业购买的hanks精子保存液。

2.2 实验验证分析

两种精子保存液实用效果对照如表1所示。

表1 两种精子保存液实用效果对照

精子保存时间/h496144 hnscz受精率/（%）98.287.681.4 hanks受精率/（%）83.013.311.5

实际人工授精验证结果：hnscz保存的精子144 h受精率81.4%，保持较高水平，与流式细胞仪测试的DNA断裂指数hnscz3=0.29，与较低水平结果相吻合；hanks保存的精子144 h受精率11.5%，已达到很低的水平，不能作为实际人工繁殖使用，与流式细胞仪测试的DNA断裂指数hanks3=0.32较高水平的结果一致。

2.3 镜检观察

用显微镜观察[8-9]，hnscz保存液保存的精子6 d精子活力还旺盛，7 d活力开始减弱，9 d死亡；hanks保存液保存的精子1 d、2 d活力较强，4 d活力减弱，5 d死亡。

3 结论

SCSA判定精子质量快速准确，并能量化分析，是人工保存精子使用前检测精子活力强弱的重要手段。

乌苏里拟鲿精子保存液hnscz经SCSA分析和实际应用检验，在4 ℃冰箱中可以人工保存一周时间并保持精子活力旺盛，是实现规模化繁殖的保证。

对于乌苏里拟鲿人工保存的精子来说，根据参考文献[1]和测试实验结果分析认为，DNA断裂指数≤0.15则精子活力旺盛，保存的精子可以作为人工授精的精子来源。DNA断裂指数≥0.3则精子趋于衰竭，不再作为人工授精的精液来源。

［1］Apedaile AE，Garrett C，Liu DY，et al. Flow cytometry and microscopic acridine orange test：relationship with standard semen analysis［J］.Reprod Biomed Online，2004，8（04）：398-407.

［2］杨家云.瓦氏黄颡鱼精巢发育及精子生物学研究［J］.西南师范大学学报（自然科学版），2005，30（04）：719-724.

［3］陈松林.鱼类精子和胚胎冷冻保存理论和技术［M］.北京：中国农业出版社，2007.

［4］陈松林，刘宪亭，鲁大春，等.鲢、鲤、团头鲂和草鱼精液冷冻保存的研究［J］.动物学报，1992，38（04）：413-424.

［5］于海涛，张秀梅，陈超.鱼类精液超低温冷冻保存的研究展望［J］.海洋湖沼通报，2004（02）：66-72.

［6］王明华，蔡永祥，陈校辉，等.乌苏里拟鲿人工繁育技术［J］.水产养殖，2010，31（04）：23-24.

［7］高征，崔杰，徐广红，等.乌苏里拟鲿人工繁殖方法［M］.长春：吉林农业大学出版社，2010.

［8］罗相忠，邹桂伟，潘光碧.大口鲇精子生理特性的研究［J］.淡水渔业，2002，32（02）：51-53.

［9］鲁大春，傅朝君，刘宪亭，等.我国主要淡水养殖鱼类精液的生物学特性［J］.淡水渔业，1989（02）：34-37.

赵道全（1964—），男，教授级高级工程师，从事鱼类遗传育种及工厂化养殖技术研究。

河南省重点科技攻关项目（编号：172102110097）

2095－6835（2019）02－0008－02

Q492

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.02.008

〔编辑：张思楠〕