芦荟多糖联合茶多酚对小鼠酒精性肝损伤的预防作用

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(1.江南大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验,江苏无锡 214122;2.江南大学食品安全国际联合实验室,江苏无锡 214122;)

中国有着千百年的酒文化历史,适度饮酒有益于身心健康,但是长期饮酒具有潜在的不良影响。而近年来,由于人类饮酒频率普遍增加以及膳食结构的不平衡变化,酒精性肝的发病率日益增高[1],成为了肝脏疾病中第二大死亡原因[1-2]。而从天然产品和传统药用植物开发出来的药物在酒精性肝病的预防和治疗中越来越受到人们的重视[3-5]。因此,为预防和治疗酒精相关性肝病,寻找有效和安全的天然产物是十分迫切的。

肝脏是人体重要的代谢器官,在各种内源性和外源性有害物质的代谢和解毒中起着至关重要的作用[6]。酒精性肝损伤主要是由于肝脏中氧化应激引起的,由于酒精代谢主要在肝脏中进行,代谢过程中会产生大量自由基,而大量研究表明自由基通过参与脂质过氧化代谢,引起细胞损伤[7]。当肝脏中自由基过量,抗氧化系统便会失衡,炎症因子大量积累,最终造成肝脏损伤[8]。

表1 小鼠分组及给药方法Table 1 The groups of mice and methods of drug feeding

注:a:150 mg/kg·bw;A:300 mg/kg·bw;b:300 mg/kg·bw;B:600 mg/kg·bw。

芦荟富含多种活性成分,一直作为一种传统食品和药物在世界范围内得到广泛的应用[9-10],研究表明芦荟提取物可以提高免疫力、治愈炎症、缓解糖尿病并发症、抑菌[11]。更有研究表明,芦荟提取物在化学性[12]、药物性[13]和酒精性肝损伤[14]中具有保护作用。芦荟多糖是芦荟叶肉中天然高分子化合物,是芦荟主要功效性成分,主要由乙酰化的甘露糖、葡萄糖、乳糖等构成,具有显著的抗炎作用[15],并且芦荟多糖可以有效改善酒精对小鼠造成的炎症反应[16],而茶多酚是多种多酚类化合物组合而成,被公认为是天然的抗氧化剂[17],茶多酚可以清除自由基,缓解氧化应激[18],从而具有抗病毒、抗炎、保护心血管系统、保护肝脏的作用[19-20]。因此,天然茶多酚是治疗氧化应激性肝损伤的优良资源。

本研究采用长期42% vol低剂量酒精灌胃及1次50% vol酒精灌胃,造成小鼠酒精性肝损伤。并且,通过灌胃单一的芦荟多糖或茶多酚,与灌胃芦荟多糖联合茶多酚相比较,分析肝脏指数、病理学指标、血清和肝脏生化指标,探讨芦荟多糖的抗炎与茶多酚的抗氧化协同作用对小鼠酒精性肝损伤的保护作用及机制。因此,本研究为芦荟多糖和茶多酚的复合产品提供了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芦荟凝胶冻干粉(库拉索品种,从200 g新鲜芦荟中制备1 g冻干粉) 云南万绿生物股份有限公司;绿茶多酚(>98%) 陕西嘉禾生物科技有限公司;总蛋白、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、肿瘤坏死因子(TNF-α)以及白介素-6(IL-6)检测试剂盒 南京建成生物工程研究所;其余试剂均为分析纯;C57BL/6小鼠(雄性,SPF级,8周龄20±2 g) 上海斯莱克实验动物责任有限公司,江南大学实验动物中心动物实验审核编号JN.No20180330c2400510[48]。

HH-4数显恒温水浴锅 上海申顺生物科技有限公司;101C-3B电热鼓风干燥箱 上海市实验仪器总厂;M5全自动酶标仪 美国Molecular Devices公司;TU-1900双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器公司;组织匀浆机 德国IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦荟多糖的制备 采用本实验室前期提取方法[16],取芦荟凝胶冻干粉用适量蒸馏水溶解至澄清,再加入4倍体积的的无水乙醇充分搅拌、混合。混合液4 ℃静置过夜,待芦荟多糖完全沉淀,混合液于4 ℃,5000 r/min,离心15 min,过滤沉淀物。并且用75%乙醇、无水乙醇、丙酮和无水乙醚连续洗涤沉淀物,采用Sevage法除蛋白(正丁醇∶氯仿=1∶4),蒸馏水透析(透析袋截留量分子量3500 Da)4次,每次2 h,最后进行真空减压浓缩并冷冻干燥即得芦荟多糖。

1.2.2 动物分组及给药 64只C57小鼠适应性饲养一周,小鼠被饲养在12 h光照和黑暗交替的环境下(温度23±1 ℃,湿度60%),正常饮食和饮水,随机分为8组,每组8只,适应性喂养一周,第二周开始灌胃,建模方法:第1～28 d胃42% vol酒精,第29 d 50% vol酒精[21],灌胃量均为0.10 mL/10 g,分组情况如表1。

表2 小鼠体质量和肝脏指数Table 2 Body weights and liver indexes of

注:与空白组相比,#表示差异显著(P<0.05);##表示与空白组相比,差异极显著(P<0.01);与模型组相比,*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01)。

1.2.3 样品的采集与处理 小鼠末次灌胃后,各组小鼠空腹(禁食不禁水)9 h后,称小鼠质量,摘眼球取血,收集血液,并取出肝脏,称量,-80 ℃保存。

1.2.4 检测指标与方法

1.2.4.1 小鼠肝脏指数的测定 小鼠颈椎脱臼处死后解剖取肝脏,用4 ℃预冷的生理盐水冲净表面浮血,滤纸拭干,称质量。计算小鼠肝脏指数

1.2.4.2 肝脏病理学检查 剪取肝左叶组织浸入4%多聚甲醛中固定,制作石蜡切片,苏木精-伊红(HE)染色,并于光学显微镜下观察肝细胞的形态变化、炎症反应、纤维化、脂肪空泡等病理改变。

1.2.4.3 血清生化指标 摘眼球取血,放置30 min,4000 r/min离心15 min,分离血清于1.5 mL离心管中,4 ℃保存。按照试剂盒说明书方法检测TC、TG、AST、ALT活力。

1.2.4.4 肝脏生化指标的检测 剪取剩余部分肝组织,用预冷生理盐水冲洗并制备10%肝脏组织匀浆,4 ℃、5000 r/min离心15 min,分离上清液,按照试剂盒说明书方法检测蛋白、GSH-Px、SOD活力以及MDA、GSH、TNF-α、IL-6含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 小鼠体质量和肝脏指数

如表2所示,各组小鼠体重和肝脏质量差异不明显。但是,比较各组小鼠肝脏指数,相比于空白组,模型组的肝脏指数极显著增加(P<0.01),并且相比于模型组,芦荟多糖联合茶多酚低、高剂量组可以显著(P<0.05)降低酒精导致的肝脏指数上升。相比于模型组,单独芦荟多糖与单独的茶多酚组肝脏指数没有显著性差异。

因此,酒精代谢会造成小鼠肝脏质量和肝脏指数上升,但是在芦荟多糖和茶多酚的干预下,这两项指标可以得到有效的改善,说明芦荟多糖与茶多酚可有效地降低酒精性肝损伤小鼠的体重与肝脏指数。

2.2 小鼠肝组织病理形态

如图1所示,空白组肝小叶结构清晰,肝索有中央静脉,肝细胞排列整齐,细胞核正常,无水肿、脂肪变性或可见病变。而模型组中肝组织切片是典型的病理特征,包括肝细胞明显肿胀、组织坏死、炎性浸润和广泛的空泡变性。相比于模型组,茶多酚低、高剂量组的小鼠肝细胞水肿情况有所改善,但肝小叶结构仍然混乱。芦荟多糖低、高剂量组炎性浸润和空泡变性情况明显改善。芦荟多糖联合茶多酚低剂量组小鼠肝细胞排列整齐,肝小叶结构紊乱情况明显减轻。

图1 小鼠肝组织H&E染色(×200)Fig.1 H&E staining of liver tissuesin mice(×200)

图2 小鼠血清生化指标水平Fig.2 Levels of biochemical indicatorson serum in mice注:a:中谷丙转氨酶ALT;b:谷草转氨酶AST;c:总胆固醇TC;d:甘油三酯TG。与空白组相比,#表示差异显著(P<0.05);##表示与空白组相比,差异极显著(P<0.01);与模型组相比,*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01);***表示差异高度显著(P<0.001);图3图4同。

酒精代谢在酒精性肝病中起着至关重要的角色,酒精的代谢产物会损伤一系列器官和系统[22]。其中,肝脏作为机体主要的代谢器官,乙醇及其衍生物的代谢反应导致肝脏毒性,引起炎症反应,产生氧自由基,引起肝细胞损伤,甚至肝细胞坏死、肝纤维化[23-24]。因此,结合以上结果,芦荟多糖和茶多酚可以有效地改善小鼠酒精性肝脏的组织病理学病变。

2.3 小鼠血清生化指标水平

由图2可知,与空白组相比,模型组小鼠血清AST、ALT、TG和TC水平极显著增高(P<0.01),升高比例分别为48.9%、58.6%、56.7%、22.8%,说明酒精性肝损伤模型建立成功。29 d的干预实验下,除了茶多酚高剂量组不能抑制TC的增高,其余各剂量组均可抑制酒精导致的AST、ALT活力和TC、TG的增高。相比于模型组,茶多酚低剂量组在血清生化指标上并没有显著性差异,而芦荟多糖联合茶多酚低有普遍的显著性差异,其中低剂量组的效果最为明显。

临床上,AST和ALT的活性被认为是肝毒性的敏感指标[25]。在本研究中,酒精可以极显著引起AST和ALT的活性升高(P<0.01),说明成功建立了酒精性肝损伤模型。

在肝病的早期阶段,TG在肝细胞中积累,导致脂肪肝的发生[26]。在AG-L组的治疗中,可以降低TG在血清中的含量,并且AG&TP-H组的治疗效果更好。但是,单独的AG和TP治疗组不能预防TC的升高。这些结果表明AG&TP组协同作用能预防急性酒精摄入引起的轻度脂肪肝。

2.4 小鼠肝脏生化指标水平

生物机体具有一个有效的防御系统来保护和降低自由基引起的损伤,即通过内源性抗氧化酶如GSH、SOD和GSH-Px来实现清除自由基和抗氧化功能[27],该抗氧化防御系统能及时且有效清除自由基,防止过氧化物介导的进一步损伤[28]。然而,当酒精摄入量造成的氧化应激平衡被打破,超过人体清除能力时,就会发生氧化应激,肝脏中的氧化应激尤为明显[6,29]。本研究通过检测小鼠肝脏中的氧化应激指标,如图3中,经过29 d的酒精刺激之后,与空白组相比,模型组的小鼠肝脏中GSH、GSH-Px和SOD均极显著下降(P<0.01),分别下降了21.4%、20.2%、25.4%。其中,MDA是脂质过氧化的第二产物,是反应组织损伤的重要指标,被广泛用作氧化应激状态的主要指标[30],但是模型组小鼠肝脏MDA的含量比空白组小鼠升高了26.2%(P<0.01)。通过单一的芦荟多糖和茶多酚干预,芦荟多糖低剂量组的GSH含量与模型组相比没有显著差异(P>0.05),茶多酚高剂量也是如此。但是,芦荟多糖联合茶多酚低剂量组却可以显著提高GSH(P<0.05)、GSH-Px(P<0.001)和SOD的活力(P<0.01),并且极显著降低MDA的含量(P<0.01),结果表明芦荟多糖联合茶多酚可以提高小鼠肝脏的抗氧化酶的活力,加速清除自由基。

图3 小鼠肝脏生化水平Fig.3 Levels of biochemical indicators on Liver in mice 注:a:还原型谷胱甘肽GSH;b:谷胱甘肽过氧化氢酶GSH-Px;c:超氧化物歧化酶SOD;d:丙二醛MDA。

2.5 小鼠肝脏中炎症因子IL-6和TNF-α的水平

图4 肝脏中白介素-6IL-6(a)和肿瘤坏死因子-αTNF-α(b)的水平Fig.4 IL-6(a)and TNF-α(b)concentration in liver tissue

除了氧化应激外,酒精性肝病的另一主要特征是炎症细胞因子的代谢,TNF-α是肝损伤模型的关键介质,通过刺激中性粒细胞和巨噬细胞,促进细胞因子的产生和炎症反应,最终导致肝细胞坏死或凋亡[31],并且,IL-6能促进免疫系统的发育和分化[32]。如图4所示,模型组的小鼠炎症细胞因子水平IL-6和TNF-α极显著高于空白组小鼠(P<0.01),分别升高了29.7%和42.3%,然而,相对于模型组,除了茶多酚高剂量组可以显著降低IL-6的水平以外(P<0.05),其余单一组分的茶多酚或者芦荟多糖均不能显著降低炎症细胞因子水平。只有芦荟多糖联合茶多酚低剂量组可以同时显著降低IL-6和TNF-α水平(P<0.05)。因此,酒精可造成小鼠体内的炎症反应,可使肝脏中炎症因子TNF-α和IL-6的显著增加,而芦荟多糖和茶多酚可以有效地改善小鼠体内的炎症反应。

3 结论

综上所述,本研究优选了芦荟多糖联合茶多酚的复方,通过小鼠酒精性肝损伤模型,证明芦荟多糖联合茶多酚可以预防小鼠酒精性肝损伤,并且两者联合具有协同作用,效果比单一成分更显著,其作用机制可能是抗自由基脂质过氧化,以减轻慢性酒精摄入引起的氧化应激和炎症。本文为芦荟多糖与茶多酚的产品进一步开发利用提供了理论依据。