兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定与调查

马超锋

(1.河南省信阳市动物疫病预防控制中心,河南 信阳 464000)

支气管败血波氏杆菌(B6)是一种革兰阴性小杆菌,可以引起多种哺乳动物(包括猪、兔、绵羊、牛、马、犬、鼠类等)呼吸道的急性或慢性炎症[1-2],轻则影响动物生长、重则造成家畜死亡,给养殖场户带来一定经济损失。笔者在临床工作中,时常接到发生呼吸道症状的病兔,为更好的防治该病,我们将收集到的病兔进行细菌分离、鉴定与药敏试验,并对河南部分地区的兔支气管败血波氏杆菌发病情况进行了初步调查,以期为该病的防控提供指导。

1 材料与方法

1.1 病料收集 2018 年11 月信阳地区某兔场兔群发生打喷嚏、呼吸困难、不食、消瘦及鼻炎症状,无菌取病死兔的鼻拭子或鼻腔分泌物,保存备检;于2016 年7 月-2018 年6 月,在河南部分地区(信阳、焦作、济源、三门峡、驻马店和洛阳等地)有呼吸道症状兔养殖场采集鼻拭子样品684 份,冷冻保存备检。

1.2 主要试剂 DNA 提取试剂盒,购自TaKaRa 公司;普通TapDNA 聚合酶、10×缓冲液、dNTP、DNA Marker、琼脂糖等,购自宝生物工程(大连)有限公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;TSB 培养基、LB 培养基、麦康凯培养基、血琼脂平板、胎牛血清、细菌生化鉴定管、药敏片(部分自制)等,购自郑州安图绿科生物公司;革兰染色试剂根据参考文献[3]自行配置。

1.3 主要仪器 生物显微镜(日本Nikon 公司);5424R 高速台式冷冻离心机(德国Eppendorf 公司);核酸提取仪(西安天隆科技有限公司);PCR 仪(德国Biometre 公司);电泳仪、凝胶成像系统(以色列DNA 公司);HH 数显恒温水浴锅(江苏金坛晶玻实验仪器厂);SPX-150B 智能型生化培养箱(上海琅轩实验设备有限公司)。

1.4 细菌分离鉴定及镜检 将新鲜无菌采集的兔鼻腔分泌物,划线接种于血琼脂平板、麦康凯平板上,37 ℃温箱培养24～48 h 后,观察菌落形态,挑取优势生长菌落继续纯培养;取兔鼻腔分泌物、单个培养基菌落涂片,革兰染色,显微镜下观察。

1.5 生化鉴定 在含有5%胎牛血清的LB 液体培养基中接种纯培养物,取少量培养液加入各个生化鉴定管中,在温箱中37 ℃培养24 h 后,观察并记录结果。

1.6 细菌的PCR 鉴定及测序 采用DNA 提取试剂盒提取分离菌及采集的鼻拭子的DNA。

参考文献[4],建立基于多杀性巴氏杆菌16S rDNA 基因的PCR 检测方法;上游引物：5′-AGTGGGATTAGGTAGTTGGT-3′,下游引物：5′-CTGTAATTAACGTCAATG-3′,扩增片段大小为258 bp;反应条件：95 ℃5 min,94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃1 min,35 个循环,最后72 ℃延伸10 min。

参照笔者建立的兔败血支气管波氏杆菌PCR检 测方法[5]操作;上游引物：5′-GGCACCATCAAAACGCAGAGGGG-3′,下游引物：5′-ATTACCGAGTTGGGCGGGGCTG-3′,扩增片段大小870 bp;反应条件：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s,57 ℃退火30 s,72 ℃复性1 min,30 个循环,72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。对采集的样品及培养物进行PCR 扩增,电泳检测,提取阳性质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,并将测序结果进行同源性比较。

1.7 药敏试验 参考相关文献[3,6-9],利用纸片法测定分离的支气管败血波氏杆菌对庆大霉素、克林霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、盐酸多西环素、阿莫西林、氟苯尼考、链霉素、头孢克肟、头孢拉定等10 种药物的敏感性,通过测定抑菌圈的直径(Φ)判定药物对病原菌的敏感性：Φ≥15 mm 为高度敏感;6 mm≤Φ＜15 mm 为中度敏感;Φ＜6 mm 为耐药。

1.8 兔支气管败血波氏杆菌感染情况调查 将采自河南信阳、焦作、济源、三门峡和洛阳等地的684份兔鼻拭子样品进行PCR 检测,调查兔群支气管败血波氏杆菌的阳性率。

2 结果

2.1 细菌分离及镜检结果 分离菌在血琼脂平板培养48 h 后,形成隆起的中等大小的圆整、光滑、湿润、透明菌落,边缘整齐,产生β 溶血环;分离菌在麦康凯培养基上长出的菌落呈蓝灰色。革兰染色后,显微镜下观察,可见单个散在、两极染色的球杆菌,革兰阴性(见中插彩版图1),结合生化鉴定结果初步判定为支气管败血波氏杆菌。

图1 分离菌株的染色镜检图片(10×100)

2.2 生化鉴定结果 该分离菌株生化鉴定结果,能利用柠檬酸盐,还原硝酸盐,分解尿素,触酶、氧化酶、脲酶阳性;不发酵糖类,不产生硫化氢,甲基红、V-P 和吲哚试验阴性。

2.3 分离菌株PCR 鉴定结果 将分离细菌进行PCR 扩增、1%琼脂糖凝胶电泳后,巴氏杆菌扩增结果为阴性;在870 bp 处出现明显条带,与预期目的片段一致,将测序结果与已发表的兔波氏杆菌基因序列比对,同源性达99.2%以上,确定本试验分离菌为支气管败血波氏杆菌(见图2)。

图2 被检样品兔支气管败血波氏杆菌PCR 扩增图

2.4 药敏试验结果 对分离菌株药敏试验结果见表1,分离细菌对庆大霉素、恩诺沙星、氟苯尼考高敏;对诺氟沙星、盐酸多西环素中敏;对克林霉素、阿莫西林、链霉素、头孢克肟、头孢拉定不敏感。

2.5 兔波氏杆菌调查情况 利用PCR 方法,将采自河南信阳、驻马店、济源等地区的684 份兔鼻拭子样品进行PCR 检测,81 份样品阳性,阳性率为11.8%。从表2 可以看出,各地阳性率有差异。

表1 分离菌药敏试验结果

表2 河南不同地区兔群波氏杆菌感染情况

3 讨论

波氏杆菌病是一种重要的人兽共患病,对人畜健康均能造成较大威胁,因此对波氏杆菌的研究具有重要的公共卫生意义。对兔群来说,在秋冬季节及气温骤变时,较易发生呼吸道疾病,而且以发病率高、传染性强、复发率高为特征,多为混合感染,给诊断和治疗带来难度。兔传染性鼻炎是由多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌混合或单一感染引起的疾病,不同品种、不同年龄均易感,影响兔群采食和生长,是造成家兔生长迟缓的重要因素。本试验采用细菌分离培养、镜检、生化及PCR 鉴定等手段,在信阳地区发生呼吸道疾病的兔群中分离到兔源支气管败血波氏杆菌;为防治该病,采用药敏试验筛选出恩诺沙星、氟苯尼考、庆大霉素为高敏药物。根据药敏试验结果,推荐养殖户采用庆大霉素配合清瘟败毒散拌料连用7 d 防治,后经回访得知,兔场病情已得到有效控制。

对河南信阳、济源、洛阳、焦作、三门峡和驻马店等部分地区兔群的波氏杆菌感染情况进行了调查,总体阳性率为11.8%,感染率较高的济源为15.4%,最低的信阳为8.9%,该菌在我省不同地区兔场不同程度存在,从业者要加强对兔支气管败血波氏杆菌病的诊断和防治,以减少该病带来的经济损失。

兔支气管败血波氏杆菌是呼吸道传染病病菌,可经病兔喷嚏、咳嗽产生的飞沫等分泌物污染的饲料、饮水、物品和环境传播,建议兔场采取综合性防控措施来防治该病：一是坚持自繁自养,防止外来病菌进入兔群,定期采用细菌学或者血清学方法对兔群进行抽检,发现阳性立即淘汰;二是引种时,首先要隔离观察1 个月,并进行检测,及时淘汰阳性兔,无可视症状后再转群;三是加强饲养管理,改善饲养环境,给兔群营养合理的饲料,定期在饲料中添加保健性药物,在季节变换和气温骤变时要及时在饲料或饮水中添加抗应激药物,提高兔群抵抗力;四是兔舍的清洁卫生要做好,定期驱虫、灭鼠,及时清粪,保持兔舍合适的温湿度,减少各种应激因素;五是发病兔群可以制备自家苗,有针对性的免疫兔群。