新疆部分地区马驽巴贝斯虫病感染PCR 检测调查

张梦圆,吾力江,姜 媛,宋晶晶,王盼举,闻秀秀,王莉君,巴音查汗

(1.新疆农业大学动物医学学院,新疆 乌鲁木齐830052;2.新疆哈密市伊吾县畜牧局畜牧工作站,新疆 乌鲁木齐 839200)

驽巴贝斯虫病是由驽巴贝斯虫寄生于马、骡、驴等马属动物体内的蜱传血液原虫病[1]。其虫体大于红细胞半径,该病的临床症状呈现稽留热型、贫血、黄疸、血红蛋白尿,部分急性病例会导致死亡。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B 类疫病,我国将其列为二类疫病,该病呈全球性分布流行,具有很明显的季节性,无周期性,且热带、亚热带地区居多,巴西、南非、土耳其等国均有报道;我国新疆、甘肃、内蒙古、吉林、广州等地均存在马驽巴贝斯虫病相关报道[2]。据相关文献报道共有3 属14种的媒介蜱传播该病,其中我国已查明可以传播马驽巴贝斯虫的媒介蜱包括草原革蜱、银盾革蜱、中华革蜱[3];银盾革蜱是新疆驽巴贝斯虫的传播者。马属动物被携带有病原的媒介蜱叮咬后,驽巴贝斯虫随蜱虫唾液进入马属动物血液内,寄生于马属动物的红细胞内[4]。亚急性、慢性病例终身成为带虫宿主[5]。近年来新疆马产业日益发展,随着马属动物调用、运输的频繁,马驽巴贝斯虫病的感染也不断增加,严重影响和制约着马产业的发展。

为了解新疆部分地区马匹感染马驽巴贝斯虫病情况,本试验针对马主产区采集样品,通过PCR[6-7]方法对所采集的样品DNA 进行病原检测,并对结果进行差异情况分析,以便了解新疆马驽巴贝斯虫病的重疫区、威胁区、疑似区分布状况和对新疆马产业的危害程度,为该病的综合防制奠定基础数据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集与保存 2016 年3-4 月和2017年4-5 月在北疆伊犁昭苏种马场、阿勒泰和吐鲁番托克逊分别采集165 份、58 份和11 份血液,在南疆巴音布鲁克牧场、和静分别采集72 份和198 份血液,共计504 份。

1.2 主要试剂及实验仪器 树脂型TM 基因组DNA 提取试剂盒,购自北京赛百盛基因技术有限公司;PCR 扩增试剂,购自生工生物工程(上海)股份有限公司;T100TMThmal Cycler PCR 仪、Gel Doc 2000 紫外凝胶成像系统,购自美国Bio-Rad 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 马驽巴贝斯虫全基因组核酸的提取 严格参照全基因组DNA 提取试剂盒操作说明书提取DNA,-20 ℃备用保存。

1.3.2 PCR 目的片段的扩增及序列比对分析 以提取的血液基因组DNA 为模板,参照瓦热斯等[6]扩增马驽巴贝斯BC48 基因的目的片段合成,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。马驽巴贝斯虫引物：

BC48-F：5′-GCGACGTGACTAAGACCTTATTGG-3′,BC48-R：5′-GTTCTCAATGTCAGTAGCATCCGC-3′,扩增特异性片段长为452 bp。采用13 μL 反应体系以全血基因组DNA 为模板,Mix 6.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA 模板2 μL,灭菌去离子水加2.5 μL。反应条件为95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s;56 ℃退火45 s;72 ℃延伸1 min;35 个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。阳性和阴性对照样品DNA 由寄生虫实验室提供。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。将检测的阳性样品DNA 为模板,Mix 25 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,DNA 模板3 μL,灭菌去离子水至50 μL。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化目的片段,与pEASY-T1 Cloning Kit 载体连接,转化E.coliDH5α 感受态细胞,于含氨苄青霉素的LB 固体培养基上培养12～16 h,挑单菌落于含氨苄青霉素5 mL LB 液体培养基中扩大培养,菌落PCR 检测,阳性质粒送昆泰锐生物工程股份有限公司测序。序列经NCBI(BLAST)和GENETYX 软件比对分析。

1.4 统计与分析 运用SPSS 19.0 软件对不同地区不同年龄段马感染马驽巴贝斯虫情况进行单因素方差分析。

2 试验结果

2.1 PCR 方法扩增马驽巴贝斯虫结果 对马血液基因组DNA 进行马驽巴贝斯BC48 基因扩增,采用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳,获得452 bp 的目的条带,与预期片段大小相符,见图1。

图1 南北疆部分马驽巴贝斯虫BC-48 基因PCR 扩增结果

2.2 序列分析结果 测序结果经NCBI(BLAST)和GENETYX 软件进行序列比对,扩增结果与3 个已知的驽巴贝斯虫BC 48 基因序列比对,结果表明与JN217099.1 和KY111763.2 有3 个碱基不同,同源性为99%;与KY111764.2 有4 个碱基不同,同源性为99%,见图2。

图2 驽巴贝斯虫BC 48 基因序列与已知序列比对分析

2.3 南北疆不同地区马驽巴贝斯虫感染结果 对北疆昭苏种马场、阿勒泰和吐鲁番托克逊以及南疆和静和巴音布鲁克牧场所采集的样品经PCR 检测,结果表明,所检测的504 份马血液中有54 份为阳性,阳性率为10.71%(54/504)。其中北疆昭苏种马场、阿勒泰、吐鲁番托克逊马驽巴贝斯虫阳性率分别为20.61%(34/165)、5.17%(3/58)、0(0/11);南疆巴音布鲁克牧场、和静马驽巴贝斯虫阳性率分别为0(0/72)、8.59%(17/198)。

2.4 不同年龄段马驽巴贝斯虫感染结果 对X≤3,3＜X≤6,6＜X≤9,X＞9 四个年龄段马驽巴贝斯虫感染情况进行检测,4 个年龄段马驽巴贝斯虫感染率分别为9.76%、10.53%、11.21%和11.65%,见表1。

表1 不同年龄段马驽巴贝斯虫PCR 检测结果

2.5 不同地区马感染马驽巴贝斯虫情况单因素方差分析 针对北疆、南疆部分地区马匹感染马驽巴贝斯虫情况使用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析。结果显示,昭苏种马场与阿勒泰和巴音布克牧场存在极显著性差异(P＜0.01);巴音布鲁克牧场与和静之间存在极显著性差异(P＜0.01);昭苏种马场与吐鲁番托克逊存在显著性差异(P＜0.05),其余各地方差异不显著(P＞0.05)。

2.6 不同年龄段马驽巴贝斯虫感染情况单因素方差分析 本次试验对样品采集地区的不同年龄段(X≤3,3＜X≤6,6＜X≤9,X＞9)马驽巴贝斯虫感染情况使用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析。结果表明,各个年龄段马驽巴贝斯虫感染无显著性差异(P＞0.05)。

3 讨论与小结

目前,国内对马驽巴贝斯虫病的诊断通常使用血液涂片、PCR、ELISA 等常规的检测方法。血液涂片镜检法手段操作简便直接,然而其针对涂片人员和涂片技术要求较高,染虫率低时,漏检的可能性大;酶联免疫吸附试验(ELISA)在检出带虫宿主[4]上是最好的一种血清学检测方法;针对潜伏期和隐性感染阶段,PCR 检测方法应用普遍,敏感性、特异性较高,在基层检测工作中,PCR 的方法更容易掌握和操作,结果可靠,易于推广[7]。

本试验主要通过对北疆昭苏种马场、阿勒泰和吐鲁番托克逊以及南疆和静和巴音布鲁克牧场所采集的样品用PCR 方法对马驽巴贝斯虫病原DNA 进行了检测,并分析了不同地区、不同年龄段利用PCR 对马驽巴贝斯虫检测结果,以期为不同疫区的放牧马驽巴贝斯虫病综合防治奠定基础。

马驽巴贝斯虫病在不同地区的流行情况均存在差异,这与当地宿主马的分布、媒介蜱的出没规律、流行因素等3 个环节有密切关系。在5 个不同的地区用PCR 方法的检测结果中,北疆昭苏种马场马驽巴贝斯虫的阳性较高为20.61%(34/165),南疆和静地区马驽巴贝斯虫阳性率8.59%(17/198)。与Xuenan Xuana[8]所分析的新疆本地马驽巴贝斯虫感染率为2.2%～38.7%结果一致。其中吐鲁番托克逊牧场和巴音布鲁克牧场的阳性率为0。经单因素方差分析后,发现昭苏种马场与阿勒泰和巴音布克牧场分别存在极显著性差异(P＜0.01);巴音布鲁克牧场与和静也存在极显著性差异(P＜0.01);昭苏种马场与吐鲁番托克逊存在显著性差异(P＜0.05),其余各地方差异不显著。导致这一结果的原因可能是由于北疆昭苏地处北疆伊犁河谷,气候湿润,植被丰富,马产业发展规模较大。南疆和静地区春季冷暖空气交替频繁并且多大风天气,昭苏地区的地理环境与和静地区的气候环境给蜱虫孳生提供便利,而阿勒泰地区春季融雪较晚,巴音布鲁克牧场地理位置独特,分布着高寒草原,气温相对较低,不利于蜱虫孳生。同时南北疆蜱种也存在很大的差异性。昭苏种马场与阿勒泰,巴音布克牧场;巴音布鲁克牧场与和静分别存在极显著性差异(P＜0.01);吐鲁番托克逊地区气候干燥可能制约了蜱虫的繁殖。所以,昭苏种马场与吐鲁番托克逊存在显著性差异(P＜0.05)。此外,吐鲁番托克逊、阿勒泰、巴音布鲁克牧场、和静这几个调查区域在地理位置上相互接近,地理环境相差不大,故马驽巴贝斯虫的感染率差异不显著。马驽巴贝斯虫在新疆的总体感染情况呈北疆高于南疆,并且存有地方差异,这种分布特点将对其流行病学调查有着重要的意义,同时可为该病的监控提供方向。

参照朱玉涛,李永畅[9-10]年龄段划分,并依据当地牧民放牧情况,对各地区的样品进行年龄段划分。在不同年龄段PCR 检测结果中,4 个年龄段马驽巴贝斯虫感染率分别为9.76%、10.53%、11.21%和11.65%。X≤3 年龄段的感染情况低于其他年龄段,这可能与马匹未接触传播蜱或自身免疫等原因有关。对4 个年龄段进行单因素方差分析后,发现各个年龄段马驽巴贝斯虫感染情况无显著性差异。此结果与李永畅[10]所分析的结果一致。