利用SRAP与ISSR分子标记鉴别牛樟种质

王 巧, 周艳平, 郑惠成, 彭金彬, 方福钟, 邹双全

(1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002；2.莆田市荔城区西天尾镇林业站，福建 莆田 351131；3.福建省林业调查规划院，福建 福州 350003；4.泉州市洛江区林业局，福建 泉州 362011；5.漳州市林业科学研究所，福建 漳州 363000)

牛樟(CinnamomumkanehiraeHayata)属樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)植物，又名黑樟，原产地为我国台湾[1]。牛樟主要分布于海拔200～2 000 m的山区，尤其以台湾的新竹、花东及中南部较多[2]。老龄腐朽的牛樟树干内壁寄生了极具药用价值的牛樟芝，因而深受医疗保健市场的欢迎[3]。由于过度砍伐，目前牛樟天然林仅存在于交通不便的中、高海拔地区，且多为单株分散的高龄老树，结实量少，树高体大不容易攀爬，母树间授粉不易，采种也极其困难[4]。现有的大量民间引种未经系统鉴别，导致种源混乱，阻碍了牛樟的良种保存与繁育。为加强牛樟种质资源的保护与满足市场需求，需建立有效的鉴别技术。

分子标记技术已在作物遗传多样性分析、品种鉴定及遗传图谱构建等方面得到广泛应用。相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)具有遗传信息丰富、可检测的多态性强、DNA纯度要求不高、条带清晰等特点[5]，已广泛应用于水稻[6]、桃[7]及芹菜[5]等研究中。简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat, ISSR)具有遗传信息丰富、可检测的多态性强、试验操作简单并且成本较低等特点[8]。朱丽萍[8]采用ISSR分子标记技术检测牛樟、冇樟和樟树三者的族群遗传结构表明，牛樟为台湾的特有种，并认为牛樟是由樟树演变而来的。孟红岩等[9]探索了台湾牛樟总RNA的提取方法；Hung et al[10]在樟属植物中分离出了15个微卫星序列，可用于牛樟等樟属植物的鉴定；曾焕中等[11]根据樟脑素、松油醇和黄樟素含量判别是否为牛樟。目前尚未见利用SRAP与ISSR分子标记技术研究牛樟种质。福建省为适宜牛樟生长的主要地区，为此本研究在福建选取10个牛樟种质，通过SRAP与ISSR分子标记技术分析种质间的遗传多样性，以期为牛樟优质种源的保存与推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

10个牛樟种质分别取自：①福建农林大学植物园(农大牛樟)；②南安市蓬华镇苏厝村将军山(南安牛樟)；③永春县东平镇冷水村(永春牛樟1)；④永春县东平镇冷水村(永春牛樟2)；⑤德化县龙浔镇高阳村(德化牛樟)；⑥福建省林业科技试验中心(南靖牛樟)；⑦漳浦县扬基生物科技有限公司(漳浦牛樟)；⑧漳州市龙海林下国有林场(林场牛樟)；⑨永安市贡坪采育场(永安牛樟1)；⑩永安市大西坑永林种苗中心(永安牛樟2)。其中，农大牛樟与漳浦牛樟由种植人从台湾引进，并已通过台湾专家鉴定。

1.2 DNA提取与检测

2016年7月初采集发育良好且无病虫害的牛樟嫩叶，采用改进的十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB)提取DNA[12]。用Nano Drop ND-1000核酸蛋白检测仪(Nano Drop Technologies Inc，美国)检测DNA浓度，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量[13]。

1.3 SRAP-PCR扩增与引物筛选

从16个正向和16个反向引物组合的256对引物中筛选出10对具有丰富多态性的SRAP引物组合(表1),进行SRAP-PCR扩增试验。程序基本采用 Zhou et al[14]的方法，并稍作改良。

1.4 ISSR-PCR扩增与引物筛选

从哥伦比亚大学公布的100个ISSR引物中筛选出10个具有丰富多态性的ISSR引物(表2)，进行ISSR-PCR扩增试验。试验基本参照刘玉香[15]的ISSR-PCR反应体系。

1.5 统计与分析

筛选出SRAP与ISSR引物，观察其扩增结果的电泳图。在电泳图谱中，迁移性一致的DNA条带即具有同源性。采用人工读图的方式，将电泳图上有清晰条带的记为“1”，没有条带或者条带不清晰的记为“0”。根据每对引物组合扩增出来的条带计算多态性位点数目(number of polymorphic bands, NPB)、总扩增位点数目(total number of bands, TNB)和多态性位点百分比(percentage of polymorphic bands, PPB)。公式：PPB=NPB/TNB。使用NTSYS 2.1统计分析软件中Similarity程序计算10个牛樟种质间的遗传相似系数(genetic similarity, GS)，再用非加权组平均法(unweighted pair-group method using arithmetic average algorithm, UPGMA)进行聚类分析[16]。

表1 10对SRAP引物组合名称和序列

表2 10个ISSR引物名称和序列1)

1)R=(A,G),Y=(C,T),B=(C,G,T),D=(A,G,T),H=(A,C,T),V=(A,C,G)。

2 结果与分析

2.1 牛樟种质资源的多态性分析

表3 10对SRAP引物组合的扩增结果

(1)分别采用10对SRAP引物组合对10个牛樟种质进行DNA扩增。结果表明，片段大小主要集中在50～2 000 bp，10对引物总共扩增出251条条带，其中220条为多态性条带，多态性条带百分比为87.6%(表3)。Em8-Me9和Em10-Me2这两对引物组合产生的多态性条带百分比最多，均达到100%(图1)。(2)分别采用10个ISSR引物对10个牛樟种质进行DNA扩增。结果表明，扩增出来的片段大小主要集中在100～2 000 bp。10个引物总共扩增出237条条带，其中210条为多态性条带，多态性条带百分比为88.6%(表4)。UBC895和UBC900这两个引物产生的多态性条带百分比最多，均达到100%(图2)。

A.Em8-Me9；B.Em10-Me2。1～10分别为：农大牛樟、南安牛樟、永春牛樟1、永春牛樟2、德化牛樟、南靖牛樟、漳浦牛樟、林场牛樟、永安牛樟1、永安牛樟2。

2.2 牛樟种质资源的遗传相似性分析

表4 10个ISSR引物的扩增结果

分别根据SRAP、ISSR结果，用NTSYS 2.1软件计算10个牛樟种质的遗传相似系数(表5、6)。从表5可见，牛樟种质间的遗传相似系数变化范围在0.355～0.882之间，平均相似系数为0.606。从表6可见，牛樟种质间的遗传相似系数变化范围在0.371～0.814之间，平均相似系数为0.606。

2.3 牛樟种质资源的聚类分析

分别根据SRAP、ISSR扩增结果和10个牛樟种质间的遗传相似性，利用UPGMA法建立系统聚类分支树状图(图3、4)。从图3可见，在遗传相似系数为0.43时可将10个牛樟种质分成两大类，即Ⅰ类包括农大和漳浦牛樟，Ⅱ类包括南安、永春1、德化、永春2、南靖、林场、永安2和永安1牛樟。从图4可见，在遗传相似系数为0.41时可将10个牛樟种质分成两大类，即Ⅰ类包括农大和漳浦牛樟，Ⅱ类包括南安、德化、永春1、永春2、永安2、南靖、永安1和林场牛樟。

2.4 SRAP与ISSR的结果比较

2.4.1 遗传相似系数 (1)SRAP标记得到的10个牛樟种质间的遗传相似系数变化范围在0.355～0.882之间，平均相似系数为0.606，农大牛樟和永春牛樟1的遗传相似系数(0.355)最小，永春牛樟1和德化牛樟(0.882)最大。将农大牛樟与其余9个牛樟种质相比，农大牛樟与漳浦牛樟的遗传相似系数(0.755)最大。

A.UBC895；B.UBC900。1～10分别为：农大牛樟、南安牛樟、永春牛樟1、永春牛樟2、德化牛樟、南靖牛樟、漳浦牛樟、林场牛樟、永安牛樟1、永安牛樟2。

表5 10个牛樟种质间的遗传相似系数(SRAP)

Table 5 Genetic similarity coefficient of 10C.kanehiraebased on SRAP amplification profiles

牛樟农大南安永春1永春2德化南靖漳浦林场永安1永安2农大1.000南安0.3821.000永春10.3550.8731.000永春20.4950.7050.6501.000德化0.3640.8450.8820.6771.000南靖0.4140.6860.6770.7820.7051.000漳浦0.7550.4450.4360.4680.4090.4051.000林场0.4360.7180.6730.7860.6730.8320.4821.000永安10.3680.6230.6590.5910.6320.6270.4860.6231.00永安20.3730.7000.6550.7770.6910.8230.4270.8360.6591.00

表6 10个牛樟种质间的遗传相似系数(ISSR)

图3 10个牛樟种质的SRAP聚类图

图4 10个牛樟种质的ISSR聚类图

(2)ISSR标记得到的10个牛樟种质间的遗传相似系数变化范围在0.371～0.814之间，平均相似系数为0.606。永春牛樟2和漳浦牛樟的遗传相似系数(0.371)最小，南安牛樟和德化牛樟的遗传相似系数(0.814)最大。将农大牛樟与其余9个牛樟种质相比，农大牛樟与漳浦牛樟的遗传相似系数(0.743)最大。将SRAP与ISSR数据整合得到的遗传相似系数变化范围在0.412～0.847之间，平均相似系数为0.603，所得结果均与SRAP一致。

2.4.2 聚类分析 SRAP和ISSR分子标记的聚类分析图略有不同，具体表现为SRAP将永安牛樟1单独分在Ⅱb类，而ISSR将林场牛樟单独分在Ⅱb类。将SRAP与ISSR数据整合得到的聚类分析结果与SRAP的结果更具有一致性，除了林场牛樟和永安牛樟2顺序稍有不同，其他分类几乎相同。

利用Mantel检验SRAP、ISSR和SRAP+ISSR三者相似系数的相关性，SRAP与ISSR之间的相关系数为0.864；SRAP与SRAP+ISSR之间的相关系数为0.977；ISSR与SRAP+ISSR之间的相关系数为0.952。以上表明，SRAP和ISSR遗传相似系数都与SRAP+ISSR数据整合得到的遗传相似系数的相关性较高，SRAP标记更接近于两标记的综合遗传多样性。

3 讨论

遗传相似系数对鉴别牛樟种质有着重要意义。本研究表明，SRAP分析中农大牛樟与漳浦牛樟的遗传相似系数为0.755，与其余8个种质遗传相似系数均低于0.500。ISSR分析中，农大牛樟与漳浦牛樟的遗传相似系数为0.743，与其他牛樟均低于0.530。农大牛樟与漳浦牛樟已鉴定为台湾牛樟[8,17]，本研究结果也证明了两者为同一种源。

本研究通过SRAP与ISSR分子标记技术将10个牛樟种质完全鉴别出来,说明这两种分子标记技术对植物的鉴别均具有一定的可靠性。两者也存在一定的差异性，由于SRAP分子标记是对开放阅读框进行特异性的扩增[18]，而ISSR分子标记检测的是位于反向排列的简单重复序列间的基因组DNA片段[19]。SRAP、ISSR均与SRAP+ISSR相关性较强，说明利用2种或2种以上的分子标记相结合，具有较高的可信性和一致性[20]。SRAP+ISSR的聚类分析结果与SRAP更具一致性，除林场牛樟和永安牛樟2顺序稍有不同，其他分类几乎相同。因此，在经济条件有限的情况下，仅使用SRAP分子标记便可达到良好的鉴别效果。

目前关于牛樟分子标记技术体系的研究甚少，本文首次采用SRAP与ISSR分子标记鉴定牛樟种质，为有效鉴别牛樟与杂樟奠定基础。