多重PCR快速检测化妆品中三种致病菌的研究

杨英

【摘 要】目的：探讨多重PCR快速检测在化妆品中三种致病菌中的应用效果。方法：参考已有的大肠杆菌phoA基因、铜绿假单胞菌外膜蛋白基因oprL与金黄色葡萄球菌特异性序列Smal中引物，对化妆品中常见的常见的三种致病菌采用PCR进行检测、分析。结果：多重PCR扩增结果显示：根据筛选的3对特异性引物对3个标准菌株、3个混合标准菌株及6个污染菌株进行扩增，实验中出现3对引物均能对应的菌株发生特异性结合，出现一条预期扩增长度一致的清晰的条带，6株其他菌株均未出现增出条带。结论：利用多重PCR快速检测用于化妆品三种致病菌检测中效果理想，值得推广应用。

【關键词】多重PCR;快速检测;化妆品;致病菌;应用效果

【中图分类号】R256.21【文献标识码】A【文章编号】1005-0019（2019）22--01

临床研究表明：微生物指标是化妆品卫生质量合格与否的重要影响因素[1]。我国《化妆品卫生规范》中明确规定每克或每毫克化妆品中不得检出粪便大肠菌群、铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌[2]。本文以病例随机对照展开，探讨多重PCR快速检测在化妆品中三种致病菌中的应用效果，报道如下。

1 资料与方法

1.1 仪器与设备 小型高速离心机（Eppendorf）、紫外分光光度计（METASH UV5200PC）、Mastercycler nexus GSX1梯度PCR仪（Eppendorf）、凝胶成像分析系统（Bio-Rad）、细菌DNA提取试剂盒、营养琼脂培养基（广州环凯微生物科技有限公司）。

1.2 引物的合成与设计 本研究中所需的引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物见表1。

1.3 方法 （1）RNA提取。取待测化妆品，加入500uL trizol充分混合均匀后加入氯仿0.2mL，15s剧烈震荡，常温下静置2-3min，15min离心，离心力1825g，获得三层液体（上层为水相、中间层与下层为有机相）。取RNA沉淀，转移到新的EP管中，加入0.5mL异丙醇，混合均匀后放置在-20℃冰箱中，10min离心，离心力1194g获得RNA沉淀。充分洗涤RNA，加入250uL DEPC与750uL乙醇，利用乙醇完成沉淀的冲洗，5min离心，离心力2315g，取沉淀放入工作台上进行20min干燥。利用紫外分光度仪检测RNA浓度并完成RNA提纯（以Rnase作为空白对照），在A260下测定吸光度值。（2）PCR测定。多重PCR快速测定化妆品中三种致病菌。设定PCR反应条件：30℃，10min;42℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min，连续进行35个循环，最后72℃下完成10min延长，β-actin为内对照[3]。

1.4 统计分析 采用SPSS18.0软件处理，计数资料行检验，采用n（%）表示，计量资料行t检验，采用（）表示，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

多重PCR扩增结果显示：根据筛选的3对特异性引物对3个标准菌株、3个混合标准菌株及6个污染菌株进行扩增，实验中出现3对引物均能对应的菌株发生特异性结合，出现一条预期扩增长度一致的清晰的条带，6株其他菌株均未出现增出条带，见图1。

3 讨论

近年来，多重PCR快速检测在化妆品三种病菌检测中得到应用，且效果理想。本研究中，实验中出现3对引物均能对应的菌株发生特异性结合，出现一条预期扩增长度一致的清晰的条带，6株其他菌株均未出现增出条带，说明多重PCR能实现化妆品中三种病菌的检测。化妆品微生物污染不仅会给企业带来经济损伤，亦会严重危害人类的健康，通过多重PCR检测方法能同时、快速、准确的实现化妆品中大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌测定，有助于提高化妆品的使用及安全。

综上所述，利用多重PCR快速检测用于化妆品三种致病菌检测中效果理想，具有快速、特异性等优点，值得推广应用。

参考文献

冯可，胡文忠，姜爱丽，等.多重PCR法检测鲜切哈密瓜中3种食源性致病菌[J].食品科学，2017，38（6）：295-302.

瞿洋，索玉娟，徐斐，等.SSEL结合多重PCR同时快速检测生菜中4种食源性致病菌[J].上海农业学报，2017，33（4）：121-126.

刁巧虹，卞国志，王娟，等.奶牛乳房炎常见致病菌多重PCR检测方法的建立[J].动物医学进展，2017，38（12）：59-63.