青钱柳总黄酮提取工艺优化试验研究

蒋南洋，刘玮欣，刘贤贤*，张业

(1.桂林师范高等专科学校 化学与药学系，广西 桂林 541001；2.北京中科英曼环境监测有限公司，北京 100041; 3.桂林医学院，广西 桂林 541100；)

青钱柳(Cyclocaryapaliurus)系双子叶植物纲胡桃科植物，花期4～5月，果期7～9月[1],属于国家重点保护植物，被誉为“活化石”,具有生津消渴、清热解毒、降压强心之功效，实验证明：青钱柳降糖组方对Ⅱ型糖尿病大鼠高血糖症状和糖耐受情况有改善作用,对胰岛组织有保护作用[2]，可以抑制葡萄糖的吸收，从而预防由高血糖引起的一系列病症[3]。

许多的研究表明：青钱柳叶含有多种药理活性的化学成分，如黄酮类[4]、三萜皂苷类、香豆素类等。

黄酮类化合物是具有多种生物活性的多酚类化合物[5]，具有很好的防治血栓、抗衰老、降血脂、调节免疫功能等生物活性[6-7]。作为青钱柳叶的重要活性成分，黄酮类化合物的提取、测定及纯化对青钱柳资源的开发利用具有重大的研究价值和意义。

近几年对青钱柳总黄酮提取工艺主要在提取溶剂等单因素方面研究颇多。但通过数学建模方法，进行青钱柳中总黄酮成分提取的多因素影响的优化研究还未见报道。笔者通过数学建模的方法进行响应曲面法动力学试验，对广西青钱柳老叶黄酮类化合物生产工艺的优化研究，将促进青钱柳产业化生产，进一步丰富青钱柳在医药方面的功能，开辟一条经济环保高附加值产业化的新道路。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

材料：青钱柳老叶采自广西桂林伯林生物技术有限公司，采后清洗干燥后备用。

试剂：芦丁标准品(AR)、无水乙醚、亚硝酸钠、乙醇、硝酸铝、氢氧化钠等均为AR试剂。

仪器：SPECORD 200型德国耶拿紫外可见分光光度计、KQ5200DE型数控超声波清洗器、80-2型离心沉淀机、RE-2000A旋转蒸发器、JA2003N型电子天平，HH—4数显恒温水浴锅。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理

取青钱柳老叶粉碎成粉末过40目筛，称取100 g，用500 mL乙醚液冷凝回流脱脂20 h，过滤取出样品，自然风干2 h后，移入烘箱中，设置温度103 ℃，时间2 h，称重备用。

1.2.2 总黄酮提取液的制备

精确称取10 g脱脂样品，分别用浓度为65 %、80 %、95 %的乙醇在不同温度条件下，采用不同频率超声波浸提，第1次浸提固液比为1∶3(g∶mL)，时间为2 h；第2次浸提固液比为1∶2(g∶mL)，时间为1 h；第3次固液比为1∶2(g∶mL)，时间为30 min，合并3次提取液，冷却后移入250 mL容量瓶，定容后待测。

1.2.3 总黄酮含量的测定

量取5 mL脱脂青钱柳老叶总黄酮类化合物提取液，用3 000 r/min离心机离心分离20 min，用移液枪精确吸取上层清液0.5 mL移入10 mL的容量瓶中，各加5 %亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置一段时间，加入10 %硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加入4 %氢氧化钠溶液4 mL，加蒸馏水，摇匀，放置15 min后，以试剂空白做对照，用分光光度计在510 nm波长处测其吸光度[8-10]。

1.2.4 青钱柳老叶总黄酮类化合物含量的计算

根据芦丁标准工作曲线，求出相当于样品吸光度的芦丁含量，按下式求出青钱柳老叶总黄酮含量(以芦丁计)。

式中，X为样品中总黄酮含量(以芦丁计)，m1为待测液中总黄酮的量,mg，m为样品质量,g，v1为测定样品提取液体积,mL，v2为样品提取液总体积,mL[9-11]。

1.3 芦丁(芸香叶苷)绘制标准曲线

1.3.1 芦丁标准品溶液的制备

称取在105 ℃条件下烘至恒重的芦丁标准品约10 mg，用70 %乙醇定容至100 mL，摇匀，得芦丁标准溶液(每1 mL标准液含芦丁0.1 mg)。

1.3.2 标准曲线绘制

用移液枪移取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL(相当于芦丁0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mg)，置入6支10 mL容量瓶中，加5 %亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入10 %硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加4 %氢氧化钠溶液4 mL，加蒸馏水，摇匀，放置15 min后，用分光光度计测其吸光度。

图1 芦丁标准品回归曲线

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准品吸光度曲线图

芦丁标准品回归曲线见图1。

由图1可得，芦丁标准溶液的线性方程y=0.081 8x-0.003 4和复相关系R2=0.999 9，表明该回归曲线具有统计学意义，能较好地拟合实际情况。

2.2 响应面法动力学试验

选择乙醇含量(A)、温度(B)、超声频率(C)三个因素，吸光度和总黄酮含量为响应值，原料液为青钱柳老叶黄酮提取液，进行响应曲面试验[12,15]，试验设计方案和试验结果见表1。

表1 试验设计方案和试验结果

2.2.1 数学模型的建立

采用Design-Expert8.05b对表1中的实验结果进行响应曲面分析，得出的响应曲面二次方程模型方差分析的结果见表2。

表2 动力学方程方差分析表

由表2可以看出，P<0.000 1，说明该模型具有统计学意义。并且自变量一次项A，二次项A2、B2、C2为显著影响因子(P<0.000 1)和复相关系数R2=0.997 4，说明该方程与实际情况拟合良好，能准确反映乙醇含量、温度、超声频率与总黄酮含量的关系。经过回归拟合之后得到总黄酮含量V与各因子之间的动力学方程如下：

V=6.31-1.36A-4.75B+0.034C-0.013AB+0.073AC-2.975BC-0.60A2-0.37B2-0.43C2。

2.2.2 数学模型的解析

① 单因素效应

因各因素先通过标准化处理，偏回归系数将不再受因素取值影响，它绝对值得大小能够直接反映变量相对响应值的影响程度。因此，各因子对吸光度的影响顺序为：乙醇含量(A)>超声频率(C)>温度(B)。

② 因素间交互效应

根据拟合的方程利用Design-Expert8.05b软件作不同因子的响应曲面等高线图，研究乙醇含量、超声频率和温度这三个关键因子及其交互作用对总黄酮含量的影响见图2～图4。

图2 乙醇含量和超声频率对总黄酮含量影响的等高线图

图3 乙醇含量和温度对总黄酮含量影响的等高线图

图4 超声频率和温度对总黄酮含量影响的等高线图

③ 数据点的分布

根据拟合的方程利用Design-Expert8.05b软件，研究残差、预测值和试验实际值等对总黄酮含量的影响效果见图5～图7，其中残差的正态概率分布，预测值与试验实际值都靠近直线，数据点分布的线性明显，没有出现异常的数据点；残差与方程预测值的数据点较分散且无规律，进一步说明模型拟合度较好，可进行后续分析。

图5 预测值与试验实际值的对应关系

图6 残差的正态概率分布

④ 最大总黄酮含量的工艺参数

利用响应面来设计实验，根据Box-Benhnken设计原理，以最大总黄酮含量为响应值确定工艺参数，最终分析得出三个因子和总黄酮含量的最优值分别为，乙醇含量65.00 %，温度50.09 ℃，超声频率89.56 kHz，最大总黄酮含量为7.068 9 %，见表3。

表3 最大总黄酮含量响应表

2.3 最大总黄酮含量实验

以响应面设计实验得到的理论最优工艺参数为依据进行验证试验，设定乙醇含量65 %，温度50 ℃，超声频率89 kHz，进行平行实验，实验结果见表4。

表4 平行实验结果

对比表3和表4可得，以响应面设计实验得到的理论最优工艺参数和总黄酮含量最优值与实验结果相符，并得到实验条件下的优化工艺参数：乙醇含量65 %，温度50 ℃，超声频率89 kHz，最大总黄酮含量为6.913 4 %。

3 结论

以优化青钱柳总黄酮化合物提取工艺的研究鲜有报道。前人对青钱柳总黄酮提取工艺主要在乙醇和蒸馏水等单因素方面研究颇多，如：青钱柳中黄酮成分提取工艺的优化及微量元素分析[16]，但通过数学建模方法进行青钱柳中黄酮成分提取工艺的优化研究还未见报道。笔者通过数学建模的方法进行响应曲面法动力学试验，通过乙醇含量，超声频率和温度对青钱柳总黄酮优化提取工艺实验，研究得到3个因子与总黄酮含量的动力学方程为：

V=6.31-1.36A-4.75B+0.034C-0.013AB+0.073AC-2.975BC-0.60A2-0.37B2-0.43C2

通过最大总黄酮含量平行实验发现，当乙醇含量65 %，温度50 ℃，超声频率89KHz时，总黄酮含量最大，达6.9134 %，以响应面设计实验得到的理论最优工艺参数和总黄酮含量最优值与实验结果相符。