杜仲叶的营养评价及体外抗氧化活性分析

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(1.广东省测试分析研究所,广东省分析测试技术公共实验室,广东广州 510070;2.吉首大学,杜仲综合利用技术国家地方联合工程实验室,林产化工工程湖南省重点实验室,湖南张家界 427000)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)又名思仲、思仙等,为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木。传统以树皮入药,具有补肝益肾、强筋健骨、安胎等功效[1]。现代药理研究表明,杜仲叶与皮具有极其类似的化学成分及药理活性。杜仲叶作为单科、单属、单种植物,在不同地域,其内在化学成分的种类基本相同,但是由于受不同地区的土壤、温度、湿度、降雨量、经纬度以及海拔等环境条件的影响,使部分化学成分在杜仲叶内的含量存在差异[2]。湖南省张家界市慈利县素有“中国杜仲之乡”的美称,其所种植的杜仲不仅品种好,而且叶中有效成分含量高,深受消费者青睐。杜仲叶含有蛋白质、脂肪、维生素、矿物质元素等营养成分,以及木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类和多糖类等药用成分,其作为木脂素类化合物的丁香脂素二葡萄糖苷具有抗疲劳、抗癌、增强记忆力和较强的抑制cMAP磷酸二酯酶的作用[3];作为环烯醚萜类化合物桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸具有明显抗骨质疏松的生物活性[4-5];作为苯丙素类化合物,绿原酸具有抗高血压和降血脂的生物活性[6-8];作为黄酮类化合物,芦丁具有较强的降压和舒张血管的作用[9-10]。2018年4月,国家卫生健康委员会发布“关于征求将党参等9种物质作为按照传统既是食品又是中药材物质(简称食药物质)管理意见的函(国卫办食品函[2018]278号),拟将杜仲叶列入食药物质目录,为杜仲叶作为新型食品资源开发开辟了绿色通道。

有关杜仲叶的相关报道主要集中在对其功效成分的药理活性方面的研究,如Keiichi等[11]研究发现,含绿原酸、京尼平苷酸和车叶草苷的杜仲叶提取物可显著抑制由UVB诱导的接触性过敏反应;Wang等[12]研究发现,70%乙醇提取物可抑制滑膜细胞的增殖,减少软骨和骨骼的退化,从而起到缓解类风湿性关节炎的作用;Lee等[13]研究表明,杜仲叶水提物可降低体内NO水平,调节血管内皮功能障碍。杜仲叶作为我国传统饮食习惯上食用的中药材,其食用历史悠久,早在明代的《本草纲目》及清代的《广群芳谱》就有相关记载[14]。近年来,以杜仲叶为原料的产品层出不穷,如张松等[15]以杜仲叶为原料,研制出深受消费者青睐的菜点食品;罗威等[16]和张志健等[17]以杜仲叶为主要原料分别研制出具有独特风味的复合饮品。刘亮等[18]以牛乳和杜仲茶粉为原料研制出了色、香、味俱全的保健酸奶。目前,大多数学者主要侧重于杜仲叶在食品方面的开发利用,而关于杜仲叶营养成分及评价的研究却少有详细报道,严重限制了其作为新型食品资源的开发与利用。

鉴于此,本试验以慈利县杜仲叶为原料,对其营养成分及功效成分含量进行测定,并采用营养价值评价对杜仲干叶中氨基酸、微量元素等营养成分进行全面、系统的营养价值评估,以期为杜仲叶作为新型食品资源在功能性食品产品开发和深加工方面提供理论依据,同时为杜仲叶的产业化及开发应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杜仲叶 于2017年8月采摘于湖南省慈利县江垭林场(北纬29°15′51.84″ 东经11°36′36″),经吉首大学谷伏安副教授鉴定为杜仲科杜仲属杜仲叶,样品采集后50 ℃烘干,粉碎后过筛(<0.3 mm),置于干燥器内备用;硫酸铜、硫酸钾、硫酸、盐酸、硼酸、乙醇、无水乙醚、石油醚、正庚烷、氯化钠、无水硫酸钠、苯酚、柠檬酸钠、磷酸等试剂 分析纯,广州化学试剂厂;硝酸 优级纯,广州化学试剂厂;甲醇 色谱纯,Honeywell公司;甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、亚甲基蓝指示剂 分析纯,天津博迪化工股份有限公司;14%三氟化硼甲醇溶液 CNW公司;2,2-联氮-二-3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、过硫酸钾 阿拉丁试剂有限公司;羟基自由基试剂盒 南京建成生物工程研究所;抗坏血酸(VC)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、福林酚、无水碳酸钠、氢氧化钠 麦克林试剂有限公司;维生素E、B1、B2、C标准品 中国食品药品检定研究院;16种脂肪酸甲酯混合标准物质 NU-CHEK PREP公司;L-天门冬氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-半胱氨酸共17种氨基酸混合标准物质 WAKO公司生产;色氨酸标准物质 Dr.Ehrenstorfer公司;钠、镁、钾、钙、铁、铜、锌、锰、锶、硼、硒、镍、铬、钒、钴、砷、镉、锡、钡、铅、钛元素标准物质 国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院;葡萄糖、没食子酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷、芦丁标准品 中国食品药品检定研究院;实验用水 符合GB/T 6682规定的一级水。

DHG-9140A型恒温干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;N 310自动凯氏定氮仪 广州格丹纳仪器有限公司;GC-2010 plus气相色谱仪、UV-2700型紫外可见分光光度计、LC-20A型液相色谱仪 日本岛津公司;HP-88型毛细管色谱柱(100 m×0.25 mm,0.25 μm)、7800型电感耦合等离子体质谱仪 美国安捷伦公司;L-8900型全自动氨基酸分析仪、ZA3000型原子吸收分光光度计 日本日立公司;BDS HYPERSIL C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 德国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 常规理化指标测定方法

1.2.1.1 基本营养成分测定 水分测定方法按照GB 5009.3-2016[19];灰分按照GB 5009.4-2016测定[20];蛋白质按照GB 5009.5-2016测定[21];脂肪按照GB 5009.6-2016测定[22]。总膳食纤维、不溶性膳食纤维、可溶性膳食纤维按照GB 5009.88-2014测定[23]。能量、碳水化合物按照GB 28050-2011进行计算[24]。维生素E按照GB 5009.82-2016测定[25],维生素B1按照GB 5009.84-2016测定[26],维生素B2按照GB 5009.85-2016测定[27],维生素C按照GB 5009.86-2016测定[28]。

1.2.1.2 脂肪酸组成测定 脂肪酸组成按照GB 5009.168-2016进行测定[29],样品采用酸水解法进行水解,经石油醚-乙醚提取脂肪后,蒸干溶剂,加入2%氢氧化钠甲醇溶液进行脂肪的皂化,再加入14%三氟化硼甲醇溶液进行脂肪酸的甲酯化。

1.2.1.3 氨基酸含量测定 色氨酸按照GB/T 15400-1994测定[30],其余水解氨基酸按照GB 5009.124-2016测定[31],游离氨基酸按照GB/T 30987-2014测定[32]。

1.2.1.4 氨基酸营养价值与风味评价方法 食物中必需氨基酸(EAA)模式越接近人体蛋白质组成越易被消化利用。根据联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(Food and Agriculture Organization/World Health Organization,FAO/WHO)1973年建议的氨基酸评分标准模式,按下列公式计算氨基酸评分(Amino acids score,AAS)和氨基酸比值系数(Ratio coefficient of amino acid,RC),并根据AAS、必需氨基酸与总氨基酸比值(EAA/TAA)、必需氨基酸与非必需氨基酸比值(EAA/NEAA)等要素来综合评价杜仲叶的氨基酸营养价值;氨基酸风味成分按照氨基酸含量用味觉阈值比来分析,评价指标为含量阈值比(Ratio of content and taste threshold,RCT)。

AAS(%)=待测样品氨基酸含量(mg/g粗蛋白)/(FAO/WHO建议模式中同种氨基酸含量(mg/g粗蛋白))×100

式(1)

氨基酸比值系数RC=AAS/AAS的平均值

式(2)

RTC=某风味氨基酸含量(g/kg)/相应氨基酸的味觉阈值(g/kg)

式(3)

1.2.1.5 矿物质元素分析 钠元素按照GB 5009.91-2017测定[33],其余矿物质元素按照GB 5009.268-2016进行测定[34],样品按照微波消解法进行处理。

1.2.1.6 矿物质元素营养评价 采用食物营养质量指数法(Index of nutrition quality,INQ)对杜仲叶中所含矿物质进行营养评价。

INQ=100 g食物中某营养素密度/100 g食物热量密度

式(4)

式中:营养素密度=100 g食物中某营养素含量/指定人体每日所需该营养素量;热量密度=100 g食物的热量/指定人体每日所需热量。

当INQ>1时,食物提供营养素的能力大于提供热量的能力,即热量满足需求时,营养素有盈余;当INQ=1时,食物提供营养素的能力等于提供热量的能力,二者满足人体需求的能力相当;当INQ<1时,食物提供营养素的能力小于提供热量的能力,必须摄入过量的热量才能满足营养素的需求。热量的过多摄入不利于人体健康,因而INQ≥1的食物为优质食物,INQ<1的食物为劣质食物[35]。

1.2.1.7 粗多糖含量测定 粗多糖的测定按照《保健食品功效成分检测方法》(2016版)中的苯酚硫酸比色法[36]。准确称取杜仲叶样品1.0 g,置于100 mL容量瓶中,加水约80 mL,于沸水浴中加热1 h,冷却至室温后补加水至刻度,混匀后过滤,收集滤液。准确吸取滤液5 mL,置于50 mL离心管中,加入无水乙醇20 mL,充分混匀,于4 ℃冰箱静置4 h后,以4000 r/min离心10 min,反复离心3次后弃去上清液,残渣用水溶解定容至25 mL后,取适量溶液显色。以葡萄糖质量(x,mg)为横坐标,以吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程y=0.00528x-0.00575,相关系数R2=0.9990。

1.2.1.8 总多酚、总黄酮含量测定 总多酚含量测定按照GB/T 8313-2008[37]:称取0.2 g左右的杜仲叶样品置于10 mL离心管中,加入70 ℃预热的70%的甲醇溶液10 mL,搅拌均匀,立即移入70 ℃水浴中,浸提10 min(每隔5 min搅拌一次),浸提后冷却至室温,将浸提液以4000 r/min离心10 min后转移至容量瓶,残渣再用10 mL70%的甲醇溶液重复提取一次,合并上清液,定容后以没食子酸为当量测定杜仲叶中总多酚含量。以没食子酸质量浓度(x,mg/L)为横坐标,以吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程y=0.01004x+0.01846,相关系数R2=0.9996。

总黄酮含量按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中“二十四、保健食品中总黄酮的测定”进行测定[36]:称取0.5 g左右杜仲叶样品,用滤纸包紧,置于平底烧瓶中加入50 mL70%乙醇溶液,浸润后,在80 ℃水浴回流2 h,至黄酮类化合物基本提取完全。待粗提液冷却后,减压抽滤,并用少量70%乙醇溶液洗涤残渣,合并滤液后,在50 ℃下减压蒸馏,除去其中的乙醇,带溶液冷却后,收集并定容至50 mL。吸取适量的杜仲叶提取液于蒸发皿中,加1 g聚酰胺吸附,然后用甲醇洗脱,收集洗脱液,定容于25 mL容量瓶。采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定总黄酮含量。以芦丁质量浓度(x,mg/L)为横坐标,以吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程y=0.02850x+0.01470,相关系数R2=0.9999。

1.2.1.9 主要功效成分含量测定 桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷和芦丁六种最具代表性的活性成分测定参考周云雷等[38]的方法进行测定,并稍作修改。准确称取0.5 g样品,按料液比1∶20 (g∶mL)用50%乙醇水溶液超声(超声功率为400 W)提取30 min,重复提取两次后,过滤,合并滤液。滤液取1 mL用甲醇稀释至10 mL,过0.45 μm滤膜,进液相色谱仪测定。以桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷和芦丁的质量浓度(x,mg/L)为横坐标,以峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程分别为:桃叶珊瑚苷:y=5011x-16082,R2=0.9991;京尼平苷酸:y=16719x+1494,R2=0.9999;绿原酸:y=41140x+811.2,R2=0.9999;松脂醇二葡萄糖苷:y=18941x+5794,R2=0.9999;京尼平苷:y=19584x+882.8,R2=0.9999;芦丁:y=21150x+8303,R2=0.9999。

液相色谱条件:色谱柱为Thermo BDS HYPERSIL C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相A为甲醇,B为0.1%磷酸水溶液。梯度洗脱:0～6 min,6% A;6～13 min,6%～13% A;13～14.50 min,13%～18% A;14.50～22 min,18%～20% A;22～30 min,20%～40% A;30～45 min,40%～45% A;45%～46 min,45%～50% A;46～60 min 50%～55%。流速:0.8 mL/min,柱温:35 ℃,进样量:10 μL,程序化变波长:202 nm(0～14.5 min,桃叶珊瑚苷)、238 nm(14.5～23 min,京尼平苷酸)、326 nm(23～29 min,绿原酸)、240 nm(29～37 min,京尼平苷)、226 nm(37～40 min,松脂醇二葡萄糖苷)、254 nm(40～60 min,芦丁)。

1.2.2 杜仲叶提取物抗氧化活性测定 将一定量的杜仲叶粉按1.2.1.9提取方法制备杜仲叶提取物,于-20 ℃保存,用于体外抗氧化实验。

1.2.2.1 对DPPH自由基清除效果 参考王翔等[39]报道的方法进行测定,并稍作修改。称取一定量的DPPH,用无水乙醇溶解并配制成0.20 mmol/L溶液。分别取不同质量浓度(20、40、60、80和100 mg/L)的样品2 mL与2 mL DPPH溶液混用,于黑暗中25 ℃水浴中保温30 min,以无水乙醇为对照;其他条件不变,用2 mL无水乙醇替代DPPH溶液,以此为空白组;同时以VC(5、10、15、20和25 mg/L)和BHT(20、40、60、80和100 mg/L)作为抗氧化活性测定的阳性对照组,在紫外可见分光光度计上517 nm测定吸光值,计算杜仲叶提取物对DPPH·的清除率(ηDPPH·),计算公式见式(5):

式(5)

式中:A0-对照管吸光度值;A1-样品吸光度值;A2-空白管吸光度值。

1.2.2.2 对ABTS+自由基清除效果 参考王翔等[39]报道的方法进行测定,并稍作修改。配制不同质量浓度杜仲叶提取物(10、20、30、40和50 mg/L)及阳性对照品VC(2、4、6、8和10 mg/L)和BHT(10、20、30、40和50 mg/L)溶液。分别取0.4 mL配制好的杜仲叶提取物、VC和BHT样品溶液于10 mL试管中,加入3.6 mL ABTS+·溶液后摇晃混匀,室温下反应6 min后,在734 nm波长下检测每支试管中样品溶液的吸光度值,计算杜仲叶提取物对ABTS+自由基的清除率(ηABTS+·);其他条件不变,以无水乙醇为对照,用3.6 mL无水乙醇替代ABTS+·溶液,以此为空白组。清除率计算公式见式(6)：

式(6)

式中:A0-对照管吸光度值;A1-样品吸光度值;A2-空白管吸光度值。

1.2.2.3 对·OH自由基清除效果 试验使用羟基自由基试剂盒测定杜仲叶提取物对·OH的清除效果。体系通过Fenton反应产生·OH,当给予电子受体后,用Griess试剂显色,可形成红色物质,其呈色与·OH量成正比。试验条件和操作方法按照用户手册进行并稍作修改,测试样品配成不同浓度的溶液,以VC和BHT作为阳性对照组。·OH清除率(η·OH)计算见式(7):

式(7)

式中:A0-对照管吸光度值;A1-样品吸光度值;A2-空白管吸光度值。

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 基本营养成分分析

基本营养成分分析结果见表1,蛋白质是构成一切生命的主要化合物,是生命的物质基础和第一要素,如若缺少蛋白质,可导致人体免疫功能下降。杜仲叶中蛋白质含量(11.50 g/100 g),要高于大多数禾谷类食品[41],因此可作为一定的膳食蛋白质来源,补充人体所需的蛋白质。此外,杜仲叶中脂肪含量为5.550 g/100 g,碳水化合物含量为27.00 g/100 g,每100 g杜仲叶可提供1167 kJ能量,可作为供能物质为人体提供一定的能量。杜仲叶中膳食纤维含量丰富,总膳食纤维含量为38.40 g/100 g,其中不溶性膳食纤维含量为35.50 g/100 g,可溶性膳食纤维含量为2.890 g/100 g。不溶性膳食纤维具有增加粪便体积、刺激肠道蠕动、降低患肠癌的概率的作用,可溶性膳食纤维具有调节血糖、降低胆固醇的作用[40]。

维生素是维持身体健康所必须的一类有机化合物。杜仲叶中维生素C含量较为丰富13.40 mg/100 g,其含量高于芹菜中维生素C含量(10.50 mg/100 g)[42],维生素C广泛存在于植物组织中,是鉴定水果蔬菜产品品质的一个重要指标。同时,维生素C也是人体需求量最大的一种维生素,具有显著的抗氧化和降血胆固醇、减缓动脉粥样硬化等作用,此外,维生素C能预防和治疗坏血病,促进铁的吸收、细胞间质的生长,对辅助治疗缺铁性贫血有一定的作用,在营养与疾病防治中发挥着重要作用;维生素B2是水溶性维生素,容易消化和吸收,能促进发育和细胞的再生,促使皮肤、指甲、毛发的正常生长,其被排出的量随体内的需要以及可能随蛋白质的流失程度而有所增减;它不会蓄积在体内,所以时常要以食物或营养补品来补充。杜仲叶中维生素B2的含量为3.350 mg/100 g,高于黑枸杞中维生素B2含量(1.930 mg/100 g)[43],其可作为一定的天然维生素B2补充剂来部分替代营养补品;维生素E和维生素B1的含量分别为1.230和0.070 mg/100 g,研究表明,维生素B1具有保护神经系统的作用,此外,还能促进肠胃蠕动,增加食欲;维生素E能促进生殖,具有抗自由基氧化、抑制血小板聚集等多种作用。

表1 杜仲干叶的基本营养成分检测结果Table 1 Basic nutritional components analysis results of

2.2 脂肪酸组成分析

表2 杜仲叶脂肪酸成分分析结果Table 2 The results of fatty acid conposition analysis

脂肪酸组成分析结果见表2,从杜仲叶的脂肪中主要检测出7种脂肪酸,分别是棕榈酸(C16∶0)19.3%,硬脂酸(C18∶0)2.77%,油酸(C18∶1n9)3.89%,亚油酸(C18∶2n6)2.66%,花生酸(C20∶0)1.08%,α-亚麻酸(C18∶3n3)55.5%,二十一烷酸(C21∶0)5.44%。杜仲叶脂肪中不饱和脂肪酸比例高达62.5%,其中α-亚麻酸是杜仲叶脂肪中最主要的脂肪酸成分,含量为55.5%。α-亚麻酸是一种重要的不饱和脂肪酸,属于ω-3系列脂肪酸,可转化为二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA),同时对人体有降血脂、降胆固醇作用,有助于防治动脉粥样硬化和减少心脑缺血性疾病的发生[44]。因此杜仲叶可以作为获取α-亚麻酸的重要来源,优化所加工食品的脂肪酸组成。

2.3 氨基酸含量分析与评价

杜仲叶中的水解氨基酸和游离氨基酸检测结果见表3,从结果可以看出杜仲叶中含有齐全的水解氨基酸,总含量为9.07 g/100 g,其中必需氨基酸含量为3.88 g/100 g,必需氨基酸与总氨基酸含量百分比(EAA/TAA)为42.80%,必需氨基酸与非必需氨基酸含量百分比(EAA/NEAA)为74.90%。根据FAO/WHO推荐的理想蛋白质模式[45],其氨基酸组成EAA/TAA在40%左右,EAA/NEAA在60%以上为高质量蛋白,因此杜仲叶中的蛋白质属于优质的植物蛋白。由表4杜仲叶氨基酸评分(AAS)结果可以看出,色氨酸的含量远高于FAO/WHO建议值,AAS达到461.0%,除含硫氨基酸(蛋氨酸+半胱氨酸)和赖氨酸外,其余大部分氨基酸的AAS接近或超过100%,说明杜仲叶蛋白质中的大部分必需氨基酸的比例符合人体需求。蛋氨酸+半胱氨酸的AAS最低,仅25.80%,其次是赖氨酸,AAS为69.10%,说明蛋氨酸为杜仲叶的第一限制氨基酸,而赖氨酸为第二限制氨基酸。此外,通过计算氨基酸比值系数(ratio of coefficient of amino acid,RC),也得到相应结果。当RC=1时,说明食品中此种氨基酸的含量与氨基酸模式谱要求一致;RC>1时,说明此种氨基酸相对过剩;而RC<1时,说明此种氨基酸不足。通过计算表明,Trp含量过剩;Ile、Leu、Lys、Phe+Tyr、Thr、Val的含量略显不足;而杜仲叶中Met+Cys含量偏低,为第一限制。因此,在杜仲叶食品开发过程中,应注意与含蛋氨酸和赖氨酸的食材合理搭配,保证人体所需的必需氨基酸均衡。

氨基酸侧链基团不同,其结构会产生差异,而这一差别也影响了氨基酸的口味感官。D-型氨基酸大多以甜味为主;在L-型氨基酸中,当侧基很小时,一般以甜感占优势,当侧基较大并带碱基时,通常以苦味为主;若侧基带有芳香基团时,通常具有香味。按照氨基酸的味觉强度,可以大致把氨基酸分为甜味氨基酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Pro、His)、苦味氨基酸(Val、Leu、Ile、Met、Trp、Arg)、鲜味氨基酸(Lys、Glu、Asp)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Cys)[46]。然而,不同氨基酸的味觉阈值不同,含量高的风味氨基酸并非一定对食品的风味贡献大,因此用杜仲叶中各种风味氨基酸含量与其味觉阈值即含量阈值比(ratio of content and taste threshold,RCT)评价各种氨基酸对蒲桃口感的贡献(表3)。当RCT<1时,表明该种氨基酸对杜仲叶的整体风味无贡献;RCT≥1时,则表明该种氨基酸味觉特征影响杜仲叶的风味,且比值越大,影响越大。杜仲叶中游离氨基酸主要由天门冬氨酸55.7 mg/100 g、谷氨酸43.3 mg/100 g、丙氨酸5.36 mg/100 g、脯氨酸6.34 mg/100 g组成,其中天门冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸均是呈味氨基酸,但对杜仲叶的风味有特征影响主要是天门冬氨酸和谷氨酸。

表3 杜仲叶中水解氨基酸和游离氨基酸含量Table 3 Hydrolyzed amino acids and free amino acids analysis results of Eucommia ulmoides

注:总氨基酸:AA;*:必需氨基酸(EAA);*:鲜味氨基酸(DAA);#非必需氨基酸:NEAA。

表4 杜仲叶氨基酸评分Table 4 Amino acids scores(AAS)of Eucommia ulmoides

2.4 矿物质元素分析与评价

从表5的结果可以看出,杜仲叶含有丰富的钾和钙,含量分别为1.38×104、1.21×104mg/kg,还含有丰富的镁和铁,含量分别为2.02×103、164 mg/kg,其次含有丰富的锰,含量为144 mg/kg。杜仲叶中对人体不可或缺的元素如钾、钙、镁、铁、锌、锰的含量均高于坚果仁中的含量[48]。研究表明,过量的氯化钠摄入或由于不良饮食引起的钾/钠比值过低都会引起高血压,而实验发现杜仲叶的钾/钠比例分别为594.70,与水果和蔬菜以及人类健康的膳食标准一致(钾/钠比>2)。钙是骨骼生长、肌肉和神经功能的重要元素,而杜仲叶中含有较多的钙元素,显著高于原鳟鱼(632 mg/kg)[49]中钙的含量。二价镁离子是许多酶活性的辅助因子,杜仲叶中含有大量的镁,其含量甚至是草莓中的镁含量的2倍[50]。研究表明,缺硒会引起青少年大骨节病的发生,严重地影响骨发育和日后劳动生活能力,杜仲叶含硒量为0.215 mg/kg,具有人体硒元素的来源的潜能。

表5 杜仲叶矿物质元素分析结果Table 5 Mineral elements analysis results of Eucommia ulmoides

美国Hansen等[51]于1979年提出“营养质量指数(INQ)”概念,并认为相对于营养素的绝对含量,用INQ法评价某种食物中的营养质量优劣更直观。INQ法将热量与营养素含量结合起来,通过营养素密度与热量密度的比值,反映一定量某种食物满足人体热量需求的程度和满足人体营养素需求的程度的关系,既当人体从食物中获得的热量足够时,某种营养素是否足够。因此,本文采用INQ法对蔬菜中矿物质元素进行营养评价。由表5可知,杜仲叶中除Na以外,常见的微量元素(如K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Se)INQ值均大于1,表明当杜仲叶达到人体热量需求时,K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Se等微量元素也满足人体需求,并有所盈余。除此之外杜仲叶中含有多种人体所需的微量元素如硼、锶、钡、钛等,这些微量元素对维持人体的各项生理机能有重要作用(因钡、钛不是人体所必需的微量元素,其INQ值无法计算,所以表5中INQ值未给出)。综上所述,杜仲叶营养价值高且全面,有较高的食用和营养保健作用。

2.5 粗多糖、总多酚、总黄酮含量分析

粗多糖、总多酚、总黄酮含量分析结果见表6。杜仲叶中含有0.989 g/100 g的粗多糖,粗多糖广泛存在于真菌及植物中,具有多种保健功效,例如免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等功效。多酚类物质具有抗氧化、抗癌、抗衰老等多种药理活性[52-55],被称为“第七类营养素”,在食品、化妆品及医药等行业具有广阔的市场前景,近年来受到人们的广泛关注。杜仲叶中含有8.360 g/100 g的总多酚,其含量高于部分茶叶中的多酚含量[56]。黄酮类化合物是许多中药材的有效成分,具有多种生物活性,杜仲叶与皮具有着极其类似的化学成分及药理活性,叶中黄酮类化合物含量更是高于皮[57],而其含量的高低,更是直接影响着杜仲叶质量的优劣[58],试验测得杜仲叶中总黄酮含量为1.590 g/100 g。

表6 杜仲叶中粗多糖、总多酚、总黄酮含量分析结果Table 6 Analysis results of crude polysaccharides,total polyphenols and total flavonoids inEucommia ulmoides weight)

2.6 主要功效成分分析

本文还测定了杜仲叶中六种主要功效成分的含量,即桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷和芦丁,见表7。杜仲叶中桃叶珊瑚苷的含量为0.765 g/100 g,桃叶珊瑚苷具有抗氧化、抗炎、抗病毒、调节血压等作用,主要存在于忍冬科、车前科和杜仲科等植物中;杜仲叶中京尼平苷酸和京尼平苷的含量分别为3.020、0.0244 g/100 g,京尼平苷酸和京尼平苷具有降血糖、调血脂、神经营养、保肝利胆等作用,主要存在于茜草科、杜仲科、卫矛科等植物中[59];杜仲叶中绿原酸的含量为2.670 g/100 g,绿原酸具有保护心血管、抗氧化、抗癌等作用[60],主要存在于忍冬科忍冬属、菊科蒿属等植物中;杜仲叶中松脂醇二葡萄糖苷的含量为0.024 g/100 g,松脂醇二葡萄糖苷是杜仲叶中主要的降压成分,具有高效、安全、双向调节血压的功能[61];杜仲叶中芦丁的含量为0.067 g/100 g,芦丁具有抗肿瘤、抗炎、抗心脑血管疾病等作用,广泛存在于植物体中。

表7 杜仲叶中6种功效成分含量分析结果Table 7 6 functional components analysis results ofEucommia ulmoides weight)

2.7 杜仲叶提物体外抗氧化活性

2.7.1 对DPPH·的清除效果 由图1可知,杜仲叶提取物具有一定的清除DPPH·能力,在试验浓度范围内,对DPPH·的清除能力随提取物浓度的增大而增加,呈现量效关系。杜仲叶提取物的半数抑制质量浓度(IC50)为32.89 mg/L,BHT和VC的IC50分别为58.81、6.882 mg/L,说明杜仲叶提取物对DPPH·的清除效果要强于BHT而弱于VC。杜仲叶中酚类化合物含量丰富,其多酚类化合物的酚羟基保证了它提供质子的能力,从而达到清除DPPH·的效果。Xu等[62]研究表明,杜仲叶提取物对DPPH·有较好的清除效果,且清除效果与酚类含量有关。

图1 杜仲叶提取物对DPPH·清除效果Fig.1 Free radical scavenging effect(DPPH·)ofextract from Eucommia ulmoides leaves

2.7.2 对ABTS+·清除效果 由图2可知,杜仲叶提取物具有一定的清除ABTS+·能力,在试验浓度范围内,对ABTS+·的清除能力随提取物浓度的增大而增加,呈现量效关系。杜仲叶提取物的IC50为28.09 mg/L,而BHT和VC的IC50分别为14.34、6.349 mg/L,表明杜仲叶提取物对ABTS+·的清除能力要略弱于BHT和VC。邓等[63]研究表明,杜仲叶提取物有较好的清除ABTS+·能力,且清除效果与杜仲叶总黄酮含量呈正相关。

图2 杜仲叶提取物对ABTS·清除效果Fig.2 Free radical scavenging effect(ABTS·)ofextract from Eucommia ulmoides leaves

2.7.3 对·OH清除效果 由图3可知,杜仲叶提取物具有较强的清除·OH能力,在试验浓度范围内,对·OH的清除能力随提取物浓度的增大而增加,呈现量效关系。杜仲叶提取物的IC50为235.3 mg/L,而BHT和VC的IC50分别为287.9、284.2 mg/L,表明杜仲叶提取物对·OH的清除效果要强于BHT和VC,其清除机理可能是由于多酚类化合物的酚羟基的氢与羟基自由基结合,从而达到清除效果。李等[64]研究发现,杜仲叶提取物对·OH有较好的清除效果,且清除效果要强于VC,这与本实验结果一致。

图3 杜仲叶提取物对·OH清除效果Fig.3 Free radical scavenging effect(·OH)ofextract from Eucommia ulmoides leaves

3 结论

杜仲叶中蛋白质含量较高,膳食纤维丰富,维生素C和维生素B2含量较高,不饱和脂肪酸比例高,其中α-亚麻酸含量丰富,占脂肪的55.5%;杜仲叶中氨基酸种类齐全,其比例达到优质蛋白标准;杜仲叶中还含有丰富钾(1.38×104mg/kg)、钙(1.21×104mg/kg)、镁(2.02×103mg/kg)、铁(164 mg/kg)元素和多种对人体有益的微量元素;杜仲叶中的粗多糖、总多酚、总黄酮的含量分别为0.989、8.36、1.59 g/100 g,6种主要功效物质即桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷和芦丁的含量分别为0.765、3.02、2.67、0.0126、0.0244、0.0686 g/100 g。杜仲叶提取物具有良好的抗氧化活性,在试验浓度范围内,清除自由基效果与质量浓度呈正相关,其清除DPPH·、ABTS+·和·OH的IC50分别为32.89、28.09、235.3 mg/L。对于DPPH·体系,杜仲叶提取物的清除效果要强于BHT而弱于VC;对于ABTS+·的体系,杜仲叶提取物清除能力要略弱于BHT和VC,而对于·OH的体系,其清除效果要强于BHT和VC。杜仲叶不仅具有良好的营养价值,还含有多种功效成分,具有诸多保健功效,作为新型食品资源在食品开发及应用方面前景广阔。