QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法>测定葡萄中388种农药残留

兰 岚,周 恒,李雯婷,袁佳佳,苗 水,陈 铭,季 申

(上海市食品药品检验所,上海 201203)

随着农药种类的扩增,使用范围的日益扩大,水果蔬菜等农产品在种植和保存过程中常常受到农药污染,如果人或动物摄入的农药量超过每日允许摄入量(ADI),则可能产生毒性反应,因此亟需建立完善、通用性的农残检测平台以解决这个日益突出的食品安全问题[1-4]。QuEChERS前处理方法结合气质联用法或液质联用法测定农药残留量具有节约溶剂、操作简单、检测灵敏度高、选择性好、定性定量同时进行、结果可靠等优点,已广泛应用于水果蔬菜的农药残留分析中[5-10]。

QuEChERS法经过十几年的发展,衍生出多种精简的样品制备方式。Anastassiades等[11]于2003年首次提出采用QuEChERS前处理法测定果蔬中多农药残留,第一次使用了N-丙基乙二胺(PSA)和无水硫酸镁作为组合吸附剂。Li等[12]使用改良的QuEChERS方法,首次增加了石墨化碳作为净化填料,采用相色谱-质谱联用法(GC-MS)测定了菠菜中66种农药残留量,证实了石墨化碳可有效净化含色素较多的食品基质,减少仪器的维护频次。Lehotay等[13]和Wilkowska等[14]总结和比较了各种改良的QuEChERS前处理方法,针对不同食品基质的特性,以GC-MS、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)为分析仪器,从提取溶剂、缓冲盐体系和净化填料的种类和组合效果等进行了讨论。由于QuEChERS法是通用型快速样品前处理技术,制备得到的样品成分仍较复杂,在农药多残留研究中,常采用GC-MS法、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、LC-MS/MS法和高分辨质谱法分析样品,LC-MS/MS以其适用范围较广、在复杂基质下能完成痕量目标化合物定性定量分析等优点,现已广泛用于多农残检测中。

葡萄是浆果类农产品中贸易量最大的品种[15],种植范围大,来源广泛,种类多样,易受多种农药污染,常呈现多残留趋势,且易超过GB 2763-2016规定的限度,亟需建立通用性的检测方法获得准确的结果[16-18]。葡萄富含果酸、糖类和风味物质,基质较为复杂。本研究在前人研究基础上,进一步优化QuEChERS方法,在净化体系中引入硅胶,以有效去除葡萄中强极性成分对目标农药测定的干扰。同时,针对联合国公约和我国规定的禁限用农药、对人类存在“致癌、致畸、致突变”风险的农药以及水果蔬菜样品中检出频率高的农药共计388种,采用UPLC-MS/MS法在电喷雾正离子模式下进行MRM分析,建立了操作简便,高效、灵敏度和准确度高的分析检测平台,以满足国内外相关法规对葡萄中多农药残留检测的技术要求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

388种农药标准品和同位素内标氘代莠去津 德国Dr. Ehrensterfer GmbH公司;甲酸、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、甲醇 色谱纯,德国Merck公司;10 mol/L甲酸铵、5 mol/L乙酸铵 分析纯,德国SIGMA公司;无水硫酸镁、无水醋酸钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;Zorbax C18色谱柱、核壳柱Poroshell 120 EC-C18安捷伦;硅胶(40～60 μm,60 Å)、C18填料(50 μm,60 Å)和PSA填料(40～63 μm,60 Å) 天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1290超高效液相色谱仪 美国Agilent公司;API 6500三重四极杆串联质谱仪 美国AB SCIEX公司,配置AB SCIEX数据处理软件、电喷雾源;Sartorius MSU225P-ICE-DU型电子天平 德国Sartorius;KS 260 basic型振荡仪 德国IKA;MS 3 digital型涡旋仪 德国IKA;Milli-Q型超纯水系统 美国Milipore公司;MULTIVAP 113型氮气吹干仪 美国OI-SYS;0.22 μm滤膜 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 提取:按GB 2763《食品中农药最大残留限量》规定的可食用部位[19],取葡萄样品适量,粉碎,取约15.0 g(精确至0.01 g),于50 mL塑料离心管中,精密加入内标溶液(15 mg/L)100 μL,分别精密加入15 mL1%醋酸乙腈,涡旋使混匀,置于振荡器上剧烈振荡5 min(500次/min),以4000 r/min的转速离心5 min;再加入无水硫酸镁与无水醋酸钠的混合粉末(4∶1,m/m)7.5 g,立即摇散,置于振荡器上剧烈振荡3 min(500次/min),置于冰浴中冷却10 min,以4000 r/min的转速离心5 min,上清液待净化。

净化:取上清液9 mL,置于已预先装有300 mg硅胶、300 mg C18填料、600 mg PSA填料、和900 mg无水硫酸镁净化材料的15 mL离心管中,涡旋30 s使充分混匀,再置振荡器上剧烈振荡5 min(500次/min)使净化完全,以4000 r/min的转速离心5 min,精密吸取上清液5 mL,氮吹浓缩至约2.5 mL,以0.1 mol/L乙酸铵水溶液定容至5 mL,涡旋混匀,滤过(0.22 μm滤膜),取续滤液,待检测。

1.2.2 标准溶液的配制及标准曲线的绘制 标准储备溶液:准确称取适量标准物质,用乙腈或丙酮配制成1000 mg/L的标准储备溶液,-20 ℃保存。

内标溶液:准确称取适量氘代莠去津,用乙腈逐级稀释成15 mg/L的内标溶液。

基质混合标准使用液:分别移取一定体积的各标准储备液于100 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,得到1 mg/L的混合标准溶液。取混合均匀的空白葡萄样品15.0 g(精确至0.01 g),按1.2.1项下方法制备至净化步骤的“以4000 r/min的转速离心5 min”,精密吸取上清液1 mL,氮吹浓缩至约0.4 mL,将适量混合标准溶液加入空白基质溶液并以0.1 mol/L乙酸铵水溶液定容至1 mL,得到5、10、50、100、200和400 μg/L的基质混合标准使用液。以388种农药的标准使用液的质量浓度为横坐标,各物质的定量离子对峰面积为纵坐标,绘制基质匹配标准曲线。

1.2.3 液相色谱条件 色谱柱:Poroshell 120 EC-C18液相色谱柱(2.7 μm,3.0 mm×150 mm,美国Agilent公司);流动相:A为水(含0.05%甲酸、5 mmol/L甲酸铵),B为甲醇(含0.05%甲酸、5 mmol/L甲酸铵)。梯度洗脱程序:0～1.00 min,95% A～95% A;1.01～4.00 min,95% A～40% A;4.01～8.00 min,40% A～36% A;8.01～8.50 min,36% A～32% A;8.51～9.00 min,32% A～25% A;9.01～16.00 min,25% A～5% A;16.01～20.00 min,5% A～5% A;20.01～20.10 min,5% A～95% A;流速:0.40 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:5.0 μL。

1.2.4 质谱条件 离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测模式;电喷雾电压:5500 V;雾化气(氮气)压力:50.0 psi;辅助气压力:50.0 psi;气帘气(氮气)压力:20.0 psi;碰撞气(氮气)压力:7.0 psi;离子源温度:350 ℃;扫描时间:50 ms;碰撞室入口电压:10 V;碰撞室出口电压:12 V;本研究仅列出135种代表性农药参数的监测离子对及其相关质谱参数(见表1)。

1.3 数据处理

分别利用Analyst Software和MutiQuant 3.0.2软件(AB SCIEX)进行数据采集及处理,Excel 2013进行数据汇总和分析。

图2 乙腈(a)、甲醇(b)、丙酮(c)和乙酸乙酯(d)作为提取溶剂的总离子流图Fig.2 TIC of the acetonitrile(a),methanol(b),acetone(c)and ethyl acetate(d)as solvents for extraction

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

实验对比了2种色谱柱,安捷伦Zorbax C18色谱柱(3.5 μm,2.1 mm×150 mm)和核壳柱安捷伦Poroshell 120 EC-C18(2.7 μm,3.0 mm×150 mm);2种流动相体系:乙腈(含0.05%甲酸,5 mmol/L甲酸铵)-水(含0.05%甲酸,5 mmol/L甲酸铵)体系和甲醇(含0.05%甲酸,5 mmol/L甲酸铵)-水(含0.05%甲酸,5 mmol/L甲酸铵)体系。结果显示,使用核壳柱和甲醇-水体系,适用性好,在该梯度洗脱条件下农药出峰均匀,峰形尖锐,分离度好,保留时间适中。388种农药及内标的混合标准品溶液总离子流图见图1。

图1 388种农药及内标的混合标准品溶液总离子流色谱图Fig.1 TIC of 388 pesticides and internal standard

2.2 提取条件的优化

根据果蔬中农残研究常用的提取溶剂,比较了乙腈、1%冰醋酸乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯的提取效率。结果显示,选用乙腈作为提取溶剂,对各农药均有较好的提取效果,对葡萄基质有较强的渗透作用,提取的色素等杂质较少,与甲醇、丙酮的提取液相比,乙腈提取液颜色更浅更澄清,LC-MS/MS在m/z 50～1000范围内全扫描得到的总离子图显示,乙腈提取液的共萃物更少(图2)。加入1%冰醋酸酸化,避免碱性或中性环境不稳定的农药的降解和损失,甲草胺、敌瘟磷、辛硫磷和灭线磷的回收率提高了5%～9%。综合考虑本实验选择1%冰醋酸乙腈为提取溶剂。

2.3 净化条件的优化

净化可以减少共提取基质干扰物对定量准确度和仪器灵敏度的影响,对于多农药残留分析显得更为重要。QuEChERS方法采用分散固相萃取(d-SPE)净化技术,本研究中无水硫酸镁的用量为900 mg,旨在除去乙腈提取液中的水,保证其他净化填料的吸附效果,此外还比较了不同配比硅胶、C18、PSA的净化效果。本试验在50 mL塑料离心管中准确加入1.5 mL 1 mg/L的388种混合标准溶液,室温下氮吹至近干,称取15 g葡萄空白样品,按样品同法制备,改变净化填料配比,在0.10 mg/kg加标水平下对净化条件进行了优化。引入硅胶作为净化填料,可以去除容易沉积在进样口和色谱柱上的糖类及强极性物质,有利于数据的稳定性及仪器的维护。固定PSA用量为100 mg,分别考察了硅胶添加量为100、200、300、400 mg的回收率,在硅胶添加量为300 mg时,平均农药回收率(86.3%)最佳。C18可有效去除基质中的脂类、脂肪类等非极性杂质,固定PSA、硅胶用量分别为100、300 mg,比较了C18添加量为100、200、300、400 mg的回收率,在C18添加量为300 mg时,平均农药回收率(85.2%)达到最佳,但C18的用量对农药回收率影响较小。

表1 葡萄中代表性农药(135种)的MRM质谱参数、线性方程、相关系数和添加回收率Table 1 The MS/MS parameters,regression equation,correlation coefficients and recoveries of typical analytes(135 kinds)in grape

PSA对色素、脂肪酸、有机酸、酚类的净化效果最好,固定硅胶、C18用量分别为300、300 mg,比较了PSA添加量为200、400、600、800 mg的回收率,在PSA添加量为600 mg时,平均农药回收率(90.2%)最佳,回收率在70%～110%的农药比例最大,达到94.3%。硅胶和PSA两种固相净化吸附剂的净化效果见图3～图4。最终净化配比确定为硅胶300 mg、C18300 mg、PSA 600 mg。

图3 硅胶用量对388种农药平均回收率的影响Fig.3 Effect of the amount of silicaon the average recoveries of 388 pesticides

图4 PSA用量对388种农药平均回收率的影响Fig.4 Effect of the amount of PSAon the average recoveries of 388pesticides

2.4 基质效应

基质效应(Matrix effect)是指样品中的其他成分对目标分析物离子响应强度的影响,即基质对分析方法准确性的干扰,在GC-MS/MS和LC-MS/MS法测定农药残留的分析中,基质效应已得到系统研究[20-23]。388种农药在葡萄基质中,61.9%的农药表现为基质抑制效应。以公式Mi=[(基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率)-1]×100%来量化评价基质效应,34.8%的农药基质效应明显(|Mi|>30%),推荐使用基质匹配标准曲线法测定以保证结果的准确性。

2.5 线性关系、相关系数和检出限

按优化的实验条件,测定浓度范围为5、10、50、100、200和400 μg/L的葡萄基质混合标准使用液,以氘代莠去津为内标,绘制标准曲线。结果表明,388种目标化合物在5～400 μg/L线性范围内线性良好,相关系数(r)均大于0.99,见表1)。由于各农药添加回收率均高于60%,采用最低线性浓度水平测定检出限,以实际检测到各农药2个MRM反应的最低浓度作为最低检出浓度,折算各农药检出限均为0.005 mg/kg。该方法灵敏度较高,可以较好地满足农药残留测定的检测限要求。

2.6 方法的回收率和精密度

续表

续表

注:*为定量离子。以空白葡萄基质样品中添加回收实验确定化合物的加标回收率,3个加标水平分别为0.01、0.05、0.10 mg/kg,每个加标水平平行测定7组,加标回收率均在60%～120%范围内,相对标准偏差均小于20%(n=7),部分代表性农药的回收率和精密度数据见表1。方法的准确度和精密度均符合农药残留分析要求,方法重现性良好。

3 结论

本研究采用QuEChERS方法进行前处理,引入同位素内标,以超高效液相色谱-串联质谱为检测仪器,建立了葡萄中多农药残留的快速筛查检测方法,388种农药在3个添加水平下的回收率为60%～120%,检出限均为0.005 mg/kg。在方法的建立过程中,重点比较了不同净化条件下农药的总体回收率水平,确定净化填料的配比为300 mg硅胶、300 mg C18、600 mg PSA和900 mg无水硫酸镁,其中硅胶、PSA对含糖、果酸较多的葡萄的净化效果较为明显。该方法简便、灵敏度高,结果稳定可靠,经方法学验证,满足葡萄中多农药残留的日常检测要求,且对其它具有相似化学成分的食品中的多农药残留研究具有参考意义。