响应面法优化茵陈总黄酮提取工艺及成分结构的初步表征

(天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457)

茵陈为菊科植物滨蒿(ArtemisiascopariaWaldst. et Kit.)或茵陈蒿(ArtemisiacapillarisThunb)的干燥地上部分[1]。在中医中,茵陈主要用于治疗黄疸、肝胆疾病,如清热利湿、消黄[2]。一些含茵陈的复方对糖尿病、高脂血症、肝硬化和肝源性糖尿病都有很好的疗效[3]。茵陈中还含有多种功效成分,主要有黄酮、绿原酸、挥发油等。其中黄酮是茵陈中重要的生物活性成分,如具有良好的抑菌、抗氧化、抗肿瘤等功效[4]。

茵陈黄酮的提取方法有溶剂提取法、酶解法及超声辅助提取法等。综合比较,传统的溶剂萃取法提取技术高耗能、低产率,且酶解法对反应条件要求较高,因此选用低成本、高提取率、绿色安全的超声提取技术[5-8]。由于植物次生代谢物丰度较低且具有化学多样性,需要高灵敏度及选择性的分析方法鉴定组分结构。近年来红外光谱在中药鉴别研究中的应用受到越来越多的关注,但未见茵陈提取物的整体结构解析与鉴定的研究[9]。同时用LC-MS进行药用植物成分的定性和定量分析在过去几年中稳步增加,但主要集中于茵陈蒿汤及配方颗粒的成分研究[10-11]。本文以干燥后的茵陈粉末为原料,利用超声辅助提取茵陈黄酮类化合物,采用响应面法优化浸提工艺,通过红外光谱及液质联用技术对提取物组分初步鉴定,以期为茵陈的综合利用和开发提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茵陈(采收于5月) 河北省南和县;芦丁 中国药品生物制品检定所;甲醇 色谱纯,天津市康科德科技有限公司;乙腈 色谱纯,天津市康科德科技有限公司。

UV1102Ⅱ紫外-可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司;HNY-200B恒温培养震荡器 天津市欧诺仪器仪表有限公司;RE-2000A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;YP型电子精密天平 奥豪斯(上海)公司;SK2510LHC超声波清洗机 上海科导超声仪器有限公司;amaZon SL离子阱液相色谱质谱联用仪 美国BRUKER公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茵陈总黄酮提取工艺 将新鲜茵陈用流水清洗,将植株的根部去除,于50 ℃烘箱中烘干至恒重,粉碎磨粉过筛(60目),将粉末样品包装在聚乙烯袋中,实验期间在4 ℃的冰箱中储存。取1.0 g茵陈粉末,精密称定,在超声功率200 W,及一定的乙醇浓度、提取时间、提取温度及液料比条件下进行超声波辅助提取。

1.2.2 黄酮含量的测定 取5.0 mg芦丁标准品,精密称定,置于25 mL容量瓶中,加适量30%乙醇溶液使之溶解,定容摇匀,得到0.20 mg/mL芦丁标准溶液。精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,置于25.0 mL比色管中,加入30%的乙醇溶液补充到10 mL,加入1.0 mL 5%亚硝酸钠溶液,摇匀后静置6 min,加入l.0 mL 10%硝酸铝溶液,摇匀后静置6 min,加入l0 mL 4%的氢氧化钠溶液,再加30%的乙醇溶液至刻度,摇匀后静置15 min。以试剂为空白作为参比液,在最大吸波长510 nm处测定吸光度,以芦丁质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线[12]。得回归方程:y=11.172x+0.0075,其中y为样品的吸光度值,x为样品浓度(R2=0.99818)。根据1.2.3单因素实验及1.2.4响应面优化实验中设计的不同方法制备提取液,过滤后将滤液定容于50 mL容量瓶中,吸取适量提取液采用比色法测定其吸光值,根据回归方程,计算茵陈提取液中总黄酮质量浓度。根据式(1)计算茵陈总黄酮得率。

式(1)

式中:Y:茵陈总黄酮得率,mg/g;C:为根据标准曲线得到的提取液中总黄酮质量浓度;V1:为测定用溶液体积,mL;V2:为样品溶液总体积,mL;M:为样品茵陈粉末质量,g。

1.2.3 单因素实验 采用超声辅助提取法提取茵陈黄酮类化合物,取1 g茵陈粉末,精密称定,其他条件保持相同,分别考察提取时间10、20、30、40、50 min,提取温度40、50、60、70、80 ℃,液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 (mL/g),乙醇浓度30%、40%、50%、60%、70%,4个因素对茵陈总黄酮得率的影响。

1.2.4 响应面实验设计 根据单因素实验分析结果,选取乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取温度(C)三个因素,以黄酮得率为考察指标,根据Box-Behnken模型的实验设计原理,用Design-Expert软件安排实验组合,确定最优提取工艺。

表1 响应面实验自变量因素水平及编码Table 1 Vairables and levels in response surface analysis

1.2.5 茵陈提取物的纯化 NKA-9大孔树脂纯化茵陈黄酮粗提物的工艺条件:以10 g NKA-9大孔吸附树脂进行湿法装柱,120 mL 0.8 mg/mL(pH=5)茵陈提取物为上样液,以流速为2 BV/h上样,用60 mL 80%乙醇溶液(pH=6)为洗脱剂,以2 BV/h的速率洗脱,将洗脱液旋转蒸发得浸膏状,冻干得纯化茵陈黄酮提取物。

1.2.6 茵陈提取物组分分析

1.2.6.1 红外光谱分析 0.6 mg冻干样品及标准品与150 mg KBr混合均匀,放到玛瑙乳钵中迅速研磨成粉,在油压机上以10 t/cm2的压力,得到直径为13 mm的透明圆片。红外光谱在Nicolet iS50 FT-IR傅立叶变换红外光谱仪上扫描测定,扫描波段4000～400 cm-1,扫描次数16,分辨率为4 cm-1。

1.2.6.2 液质联用分析 色谱条件:色谱柱为Kromasil 100-5C18(150 mm×4.6 mm,5.0 um);流动相:乙腈-0.1%乙酸(乙腈为B相,0.1%乙酸水溶液为A相);检测波长:340 nm柱温25 ℃;进样量5 uL;流速:0.2 mL/min;梯度洗脱条件梯度洗脱程序:0～5 min,5%乙腈;5～15 min,乙腈由5%增加到15%;15～35 min,乙腈由15%增加到18%;35～42 min,乙腈由18%增加到25%;42～45 min,乙腈由25%减少到5%;45～90 min清洗色谱柱。将1 mg/mL提取纯化物的甲醇溶液,0.22 um滤膜除杂,340 nm波长下进行高效液相色谱分析[13]。

质谱条件:质谱离子扫描范围为200～1000;ESI离子源,正离子模式,雾化器1.5 L/min,干燥气115.0 kPa,离子源温度200 ℃。

1.3 数据处理

所有实验均一式三份,数据以平均值±标准差表示。数据使用Microsoft Office Excel 2007进行统计处理,采用SPSS 18.0软件进行实验数据的差异性分析,利用Origin 9.0绘制图像。

2 结果与讨论

2.1 茵陈黄酮提取工艺优化

2.1.1 单因素实验

2.1.1.1 时间对总黄酮得率的影响 如图1(A)所示,随着提取时间从10 min增加到30 min,得率明显提高,从(18.5±0.3) mg/g增加到(23.44±0.32) mg/g。当提取时间较短时,茵陈黄酮类化合物不能充分溶解出来,但时间过长会导致部分黄酮类化合物氧化而损失,应在保证较高得率的基础上,选取尽量短的提取时间。确定了茵陈黄酮类化合物适宜超声提取时间为30 min。

图1 时间、温度、液料比、乙醇浓度对提取率的影响Fig.1 The effect of time,temperature,ratio of liquid to solid,concentration ethanol on the extraction yields注：A:时间;B:温度;C:液料比;D:乙醇浓度。

2.1.1.2 温度对总黄酮得率的影响 如图1(B)所示,随着提取温度的增加。总黄酮得率迅速增加,然后减慢并达到平衡浓度。溶剂温度由40 ℃提高到70 ℃,得率由(22.51±0.18) mg/g提高到(24.79±0.17) mg/g。分析其原因,可能由于温度升高而导致分子运动增加,从而增加了溶解度[14]。然而,较高的温度可能导致提取物的降解或转化,或其他负面影响。因此,初步选择提取温度为60 ℃。

2.1.1.3 液料比对总黄酮得率的影响 如图1(C)所示,随着液料比从10∶1 (mL/g)增至30∶1 (mL/g),总黄酮提取率有增加的趋势,从(18.57±0.18) mg/g增至(24.42±0.25) mg/g。这可能是由于较高的液料比导致更多的溶剂进入细胞,更多的黄酮溶出至溶剂中。当液料比大于30∶1 (mL/g)时,总黄酮的提取率急剧下降,这可能是由于萃取剂过量导致传质速率降低所致。因此,初步选择液料比为30∶1 (mL/g)。

2.1.1.4 乙醇浓度对总黄酮得率的影响 如图1(D)所示,在乙醇浓度为50%～70%时,黄酮类化合物得率较高。溶剂的极性对黄酮类化合物的提取有很大影响。极性溶剂比非极性溶剂能更有效地萃取类化合物,且溶液比溶剂更有效。较高的乙醇浓度可以通过降低破坏水分布所需的介电常数和能量来增加酚类化合物的溶解度。此外,在溶剂中存在适量的水可以促进植物材料的膨胀并增加植物基质与提取溶剂之间的表面积,从而提高提取效率[15]。因此初步选择适宜乙醇浓度为50%。

2.1.2 响应面优化

2.1.2.1 响应面优化实验结果 根据单因素实验结果,选择因素与水平并设计响应面优化实验,其中超声波辅助提取茵陈总黄酮得率响应面优化实验设计及结果见表2。

表2 响应面优化实验结果Table 2 Response surface optimization experiment results

2.1.2.2 模型建立与显著性分析 应用Design-Expert软件对所得实验结果进行回归分析,获得综合评分对乙醇浓度、液料比、提取温度的二次多项回归方程式:

Y=24.50-0.15A+0.069B+0.35C+0.36AB-0.48AC-0.32BC-0.47A2-1.01B2-2.28C2

表3 响应面设计二阶回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the second-order regression model

2.1.2.3 响应面交互作用分析 应用Design-Expert软件对上述实验结果进行响应面分析,可以得到该模型的响应面图和等高线图,结果如图2所示。

从图2响应面及等高线图来看,响应面有极大值,最优配方在实验范围内,等高线均为椭圆形,说明乙醇浓度与液料比,乙醇浓度与提取温度,液料比与提取温度的交互作用对茵陈黄酮提取率影响显著。以得率的最高值为优化目标得最优工艺为乙醇浓度47.8%、液料比29.8∶1 (mL/g)及提取温度61 ℃,根据现实操作的方便性,对工艺参数进行了修正:乙醇浓度48%、液料比30∶1 (mL/g)、提取温度61 ℃,所得得率平均值为24.89 mg/g,预测值24.53 mg/g,误差为1.49%。此结果验证响应面优化模型的可靠性。

2.2 茵陈总黄酮组分结构初步表征

2.2.1 红外光谱分析 当样品处于频率连续变化的红外线辐照时,其分子吸收了某些频率的光波,获得能量后分子产生振动或由基态向激发态进行能级跃迁,使得被吸收波段的透射光强度减弱,从而进行对应官能团分析。红外光谱扫描结果见图3(A)芦丁标准品在1655 cm-1处有烯烃C=C伸缩振动峰,在1601、1505、1456 cm-1处有芳烃的C=C骨架振动峰,808 cm-1为芳烃的C-H面外弯曲振动,1296 cm-1为醇和酚的C-O伸缩振动,727 cm-1为酚和醇的O-H面外弯曲峰。2938 cm-1为烷烃的C-H伸缩振动峰,1362 cm-1为烷烃的C-H弯曲振动峰。

图2 响应面和等高线图示(a)乙醇浓度和液料比(b)乙醇浓度和温度(c)液料比和温度Fig.2 Response surface and contour plot curve illustrating combined effects of(a)Alcohol concentration and Ratio of liquidto material(b)Alcohol concentration and Temperature(c)Ratio of liquid to material and Temperature

图3 芦丁和茵陈黄酮类化合物红外光谱扫描图Fig.3 Infrared spectra of rutin and flavonoids from Artemisia capillaris

由图3(B)可知4000～500 cm-1范围内,有明显多个吸收峰。知茵陈黄酮的单体物质中含有以下官能团:3397 cm-1(3500～3200 cm-1)为分子间氢键O-H伸缩振动,且吸收峰较宽,1274、1162、1118 cm-1为醇和酚的C-O伸缩振动,说明有酚羟基的存在,1515 cm-1为芳烃的C=C骨架振动峰,814cm-1为C-H的面外弯曲振动峰;2931 cm-1为-CH3的伸缩振峰,1370 cm-1为-CH3的弯曲振动峰,证明-CH3的存在,初步推测茵陈黄酮含有芦丁等含-CH3的黄酮单体[16]。

2.2.2 LC-MS测定黄酮类化合物的组成分 茵陈黄酮类化合物液相色谱图如图4所示,液相色谱-质谱分析如表4所示,通过对比m/z值、保留时间(Tr),确定或初步表征了这些黄酮类化合物。

表4 液相色谱-质谱分析Table 4 Analysis of LC-MS

图4 茵陈黄酮类化合物液相色谱图Fig.4 Liquid chromatogram of flavonoidsfrom Artemisia capillaris

通过查阅文献[17-20],峰1(Tr=28.4 min),分子离子峰为[M+H]+(m/z 611.19),因此可确定化的相对分子质量m/z为610。在二级质谱中出现明显的m/z 465碎片峰及m/z 303碎片峰,表明[M+H]+依次失去质量数146u鼠李糖基碎片及162u葡萄糖基碎片,说明该化合物含芸香糖,生成槲皮素离子碎片,可确定该化合物为槲皮素3-O-芸香糖苷,即芦丁[21-22]。

峰2(Tr=29.1 min)和峰3(Tr=30 min),正离子模式下分子离子峰[M+H]+为均为465,推测其可能为槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷,槲皮素-3-O-葡萄糖苷或五羟基黄酮-3-鼠李糖苷,进一步分析二级质谱上出现明显的m/z 302.66的碎片峰,为糖苷丢失糖基形成的苷元离子,确定峰2,峰3可能为金丝桃苷或异槲皮苷。主要二级裂解碎片均有302.66[M-glc]+,由于这两个同分异构体结构非常相似,裂解规律相近,故进一步通过保留时间的不同,推测峰2为槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷,即金丝桃苷,峰3为槲皮素-3-O-葡萄糖苷,即异槲皮素[23-24]。

峰4(Tr=38.4 min),[M+H]+峰为m/z 479.2,推测其分子量为m/z 478,在正离子模式下二级质谱主要碎片为m/z 316.93,推测为失去162u的葡萄糖基碎片,推测其为异鼠李素-3-O-葡萄糖苷[25]。

峰5(Tr=39.9 min),[M+H]+峰为m/z 609.22,推测其分子量为m/z 608,在正离子模式下二级质谱主要碎片为m/z 463、m/z 301,推测为[M+H]+峰依次丢失鼠李糖基碎片(-m/z 146)、葡萄糖基碎片(-m/z 162),说明该化合物中含有芸香糖,可初步推测该化合物为香叶木苷[26]。

茵陈黄酮类化合物通过液相色谱电喷雾质谱联用法进行简单的鉴定及分析工作,由于类黄酮的结构极为相似,母核裂解的规律也接近一致,其他响应值较高的峰的二级质谱信息有限,未能判断推理其结构,需通过进一步的分离纯化,并通过更为细致的碎片离子信息及核磁共振技术才可准确的鉴定黄酮苷元确切的结构。

3 结论

本文通过超声辅助提取茵陈黄酮类化合物,确定其最佳工艺为提取温度51 ℃、乙醇浓度58%和液料比30∶1 (mL/g)条件下,总黄酮得率最高,可达24.89 mg/g。红外光谱扫描显示,茵陈黄酮提取物中存在羟基的伸缩振动和弯曲振动、苯环的骨架振动及苯环上C-H面外变形振动、C=C的伸缩振动,具有黄酮类化合物的典型结构。LC-MS分析表明,黄酮提取物中含有芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和香叶木苷,说明其为一种具有开发利用价值的天然功能食品原料,茵陈中黄酮含量及种类丰富,因此,作为一种极具潜力的提取黄酮类物质的资源,以茵陈为原料探索新型的应用领域,加大其在保健食品、医学及工业用品领域的研究力度,促进茵陈制品的开发研究,对提高茵陈资源的综合经济效益具有重要意义。