皂荚多糖超声波提取工艺优化及体外抗氧化活性研究

高 洁,董文宾2,3,王 勇4,*,张泉荣,张文秀

(1.陕西国际商贸学院医药学院,陕西西安 710000;2.陕西科技大学,陕西西安 710000;3.陕西省食品加工工程技术研究中心,陕西西安 710000;4.陕西农产品加工技术研究院,陕西西安 710000)

皂荚(GleditsiasinensisLam.)系豆科苏木亚科(或云实亚科)的多年生木本植物[1],我国河北、河南、陕西种植面积较广[2-3]。皂荚不仅具有抗菌、杀虫、杀鼠、抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖等活性[4-5],同时还具有免疫调节、抗凝血、抗炎等活性[6]。

皂荚的主要化学成分包含萜类化合物、黄酮类化合物、酚酸类化合物、甾体类化合物和多糖[7]。植物多糖具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、降血糖等生物学活性[8-9],研究前景较大。多糖提取方法种类较多,不同的提取方法对多糖活性影响较大,超声波提取法速度快,时间少、效果明显[10],且不受高温的影响。

当前,对于皂荚的研究报道主要集中在皂荚刺活性成分、皂荚素[11],而对皂荚多糖的提取和生物活性研究较为少见,已报道的皂荚多糖提取工艺也以回流法提取为主[12],皂荚多糖的超声波法提取和体外抗氧化性的研究未见报道。本研究将皂荚多糖作为主要研究对象,优化其超声波法提取工艺参数,并对该法所提取的皂荚多糖开展体外抗氧化活性研究,旨在为皂荚资源能够更有效的利用在医药保健领域提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

皂荚 采摘于陕西省眉县太白山,经陕西中医药大学雷国莲教授鉴定为皂荚Gleditsiajaponic.miq;VC分析纯,天津科密欧化学试剂有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基基肼(DPPH) 色谱纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;所有分离及活性测定用有机溶剂均为分析纯。

粉碎机FW100 天津市泰斯特仪器有限公司;SJIA-650W超声处理器 宁波市双嘉仪器有限公司;YP20002电子天平 上海越平科学仪器有限公司;SHZ-D(III)循环水式多用真空泵 河南省予华仪器有限公司;KDC-40低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;DZF-6020型恒温鼓风干燥箱 上海赫田科学仪器有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 皂荚预处理 称取一定量的皂荚,净制后干燥,粉碎并过40目筛,置于50 ℃恒温干燥箱中干燥后,备用。

1.2.2 皂荚多糖提取 称取皂荚粉末,按比例加入水超声提取3次,取出料液,进行离心(3000 r/min,15 min),收集滤液,浓缩,加3倍无水乙醇沉淀,脱水干燥,利用sevag法除蛋白,冷冻干燥,得皂荚多糖样品。

1.2.3 皂荚多糖含量测定 采用硫酸-苯酚法[13]进行皂荚多糖含量测定,根据线性回归方程计算皂荚多糖得率:

式(1)

式中:R:皂荚多糖含量,%;C:多糖浓度,g/mL;V:多糖溶液体积,mL;M:皂荚干粉质量,g。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 超声提取温度对皂荚多糖得率的影响 固定液料比40∶1 (mL/g),超声提取温度50 ℃,超声时间30 min,超声功率250 W,考察不同超声提取温度(40、50、60、70、80 ℃)对得率的影响。

1.2.4.2 液固比对皂荚多糖得率的影响 固定超声温度50 ℃,超声时间30 min,超声功率250 W,考察不同液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 (mL/g))对得率的影响。

1.2.4.3 超声时间对皂荚多糖得率的影响 固定液固比40∶1 (mL/g),超声温度50 ℃,超声功率250 W,考察不同超声时间(10、30、50、70、90 min)对得率的影响。

1.2.4.4 超声功率对皂荚多糖得率的影响 固定液固比40∶1 (mL/g),超声温度50 ℃,超声时间30 min,考察不同超声功率(50、150、250、350、450 W)对得率的影响。

1.2.5 响应面试验 以皂荚多糖得率为响应值,根据单因素实验结果选定水平范围,采用四因素三水平响应面设计,进行数据分析,模型确立,从而确定超声波提取皂荚多糖的最优提取工艺条件。

1.2.6 皂荚多糖体外抗氧化活性试验

式(2)

式中:R:O-2·清除率,%;A0:空白对照液的吸光度;Ai:加入皂荚多糖溶液的吸光度。

1.2.6.2 DPPH·清除能力的测定 将等体积皂荚多糖溶液及DPPH·溶液(0.2 mmol/L)混匀后避光静置反应30 min,以无水乙醇为参照,在517 nm波长处测定其吸光度Ai。同时,测得样品溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度Aj,并测得DPPH·溶液(0.2 mmol/L)与等体积无水乙醇混合液的吸光度Ac,以VC为阳性对照[16],则皂荚多糖对DPPH·的清除率计算公式如下:

式(3)

式中:R:DPPH·清除率,%;A0:DPPH·与无水乙醇混合液的吸光度;Ai:DPPH·与样品反应后的吸光度;Aj:不加邻苯三酚的皂荚多糖与无水乙醇溶液的吸光度

1.2.6.3 ·OH清除能力的测定 取10 mmol/L水杨酸钠-乙醇溶液、10 mmol/L FeSO4溶液、待测样品各1 mL,混匀后于37 ℃恒温水浴反应30 min。加入1mL 0.03% H2O2溶液,反应结束后于510 nm处测定样品吸光值[17-19]。空白组用H2O代替样品,其余同样品组。以H2O作空白对照,VC作阳性对照。按下式计算清除率。

式(4)

式中:R:·OH清除率,%;A0:空白对照的吸光度;Ai:·OH与皂荚多糖反应后的吸光度;Aj:不加 H2O2的皂荚多糖与无水乙醇溶液的吸光度。

1.3 数据处理

基于皂荚多糖提取的单因素试验基础,选定影响多糖得率的4个因素:提取温度(X1)、液固比(X2)、提取时间(X3)、超声功率(X4),进行水平设定,进行Box-Behnken试验设计,得到29个试验点的设计方案,方案设计及结果如表1所示:

表1 中心组合实验Box-Behnken设计因素和水平编码值Table 1 Experimental levels employed for Box-Behnken design

注:采用Design-Expert 8.0.6软件进行数据分析、统计及作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取温度对得率的影响 如图1所示,皂荚多糖得率在超声提取初期,随着温度的增加而增加,在超声提取过程中,高温有助于加剧分子扩散运动,加速溶液原料间的相互作用,使细胞结构能更好的被破坏,多糖能够更有效的溶出,得率最大可达19.23%,但是当提取温度高于50 ℃时,随后得率不再上升,反呈现出平稳下降的趋势,温度过高可使部分糖链发生断裂,并且影响其生物活性,同时会难以控制提取条件。因此,将提取温度50 ℃选为单因素最佳温度。

图1 提取温度对皂荚多糖得率的影响Fig.1 Effect of the extraction temperature on yield ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.1.2 液固比对皂荚多糖得率的影响 图2反映了不同的液固比提取对皂荚多糖得率的影响,由结果可知,随着液固比的增加多糖得率有了呈明显的上升趋势,当液固比为40∶1 (mL/g)时,多糖得率最大可达19.02%,持续增大液固比后,多糖得率较为稳定。液固比的增加与助于原料的浸提,从而加速多糖的溶出,但溶剂量持续加大可使固液两相混合不彻底,传质不均匀,从而造成得率下降。因此,将液固比40∶1 (mL/g)选为单因素最佳液固比。

图2 液固比对皂荚多糖得率的影响Fig.2 Effect of liquid/material rate on yield ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.1.3 提取时间对得率的影响 由图3可知,当提取时间为30 min时,皂荚多糖得率最大可达19.18%,提取时间高于30 min后,皂荚多糖的得率反而随着时间的增加呈现出下降趋势。这表明,超声时间在一定范围能是可加速多糖的溶出速度,但超声时间过长可使超声空化作用增强,机械力增大,温度上升,从而将已溶出的多糖结构发生破坏。因此,将提取时间30 min选为单因素最佳提取时间。

图3 提取时间对皂荚多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on yield ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.1.3 超声功率对得率的影响 如图4所示,当超声功率为250 W时,皂荚多糖提取最大,当超声功率高于250 W时,得率有明显下降趋势。这表明,超声功率的增大有助于液固两相的相互混合和细胞结构的破碎,从而使得率增大,但功率过强,声波作用加大,机械力增强,将对多糖结构进行破坏,从而降低多糖的得率[20],同时也造成了资源的浪费,因此,将超声功率250 W选为单因素最佳提取功率。

图4 超声功率对皂荚多糖得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.2 响应曲面法优化皂荚多糖提取工艺优化

2.2.1 回归模型建立与方差分析 使用Design Expert 8.0.6进行的多次数据回归分析,皂荚多糖得率与温度(X1),液固比(X2),时间(X3)和超声功率(X4)的多元二次回归方程:

表2 优化实验设计与结果Table 2 Box-Behnken design and observed responses

表3 回归方程中各项的方差分析Table 3 Analysis result of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

图5 因素交互作用对皂荚多糖得率的响应面结果Fig.5 Response surface model plots for the interaction effects on the extration rate of polysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.2.2 交互作用分析 图5为各因素交互作用对皂荚多糖得率的响应面和等高线图。由图5(a)可知,随着提取温度和提取时间的增大,皂荚多糖得率呈现出先增高后缓慢降低的趋势,等高线呈现椭圆形,表明提取时间与提取温度两因素交互作用影响显著;由图5(b)表明,随着提取温度和超声功率的增大,皂荚多糖得率呈现出先上升后缓慢下降的趋势,等高线呈现椭圆形,且曲面较为陡峭,表明提取时间与超声功率两因素交互作用显著;图5(c)表明,皂荚多糖得率随着提取时间与液固比的增大而呈现出先增大而后平缓下降的趋势,由等高线图和响应面图可看出二者交互作用明显;图5(d)表明,随着超声功率与液固比的增大,得率呈现出先增后降的趋势,曲面图陡峭,因此二者交互作用具有一定的显著性。

2.2.3 超声波提取最佳工艺参数验证 经软件分析,可得出该模型的最佳工艺条件为:温度51.46 ℃,液固比36.89∶1 (mL/g),时间30.39 min,功率286.30 W,在此条件下皂荚多糖得率可达31.34%。为操作方便可将提取条件调整为:温度50 ℃,液固比35∶1 (mL/g),时间30 min,功率285 W,超声提取3次,在调整工艺条件下,平行做三次验证实验,得率为30.65%±0.25%,结果和预测值误差较小,表明调整后的超声波提取工艺参数可用。

2.3 皂荚多糖体外抗氧化活性试验

图6 皂荚多糖对超氧阴离子的清除作用Fig.6 Superoxide anion radical scavenging capacity ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.3.2 清除DPPH·能力的测定 由图7可知,皂荚多糖对DPPH·的清除能力随着皂荚多糖浓度的增大而增大,在现有浓度组别试验中,当多糖浓度达到4 mg/mL时,清除率达到最大值40.2%,IC50值为6.9 mg/mL;阳性对照VC浓度为4 mg/mL时,清除率达到最大值95%。

图7 皂荚多糖对DPPH·的清除作用Fig.7 DPPH radical scavenging capacity ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.3.3 清除羟自由基(·OH)能力 由图8可知,在现有浓度组别试验中,当皂荚多糖浓度为3.5 mg/mL时,皂荚多糖对羟基自由基的清除率达到最大值81.6%,IC50值为1.5 mg/mL;当阳性对照VC浓度为4 mg/mL时,VC对羟自由基的清除率达到94%,且其IC50值为0.556 mg/mL。试验结果表明,皂荚多糖清除请自由基的能力随着多糖溶液浓度的升高而升高,具有较强的羟自由基清除能力。

图8 皂荚多糖对羟自由基的清除作用Fig.8 Hydroxyl radical scavenging capacity ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

3 结论

本研究选用超声波法对皂荚多糖进行提取,在单因素实验基础上,进行响应面设计法进行参数优化,并对所提取的皂荚多糖进行体外抗氧化能力测定。超声波法优化最佳工艺参数为:温度50 ℃,液料比35∶1 (mL/g),时间30 min,功率285 W,在此条件下提取3次,得率为30.65%±0.25%。体外抗氧化研究表明,皂荚多糖对于羟自由基,DPPH自由基,超氧阴离子均具一定的清除能力,其中对羟自由基的清除力最强,清除超氧阴离子能力最弱,且其抗氧化能力与多糖浓度呈现出一定的量效关系。

皂荚多糖的得率及生物活性受品种、产地、提取方法等因素的影响较大,本研究在进行抗氧化试验时仅进行了体外的自由基清除试验,但并未对皂荚多糖在体内抗氧化能力进行测定,也未对不同方法提取的多糖抗氧化能力进行对比,后续研究将在抗氧化能力影响因素及体内抗氧化能力测定方面将开展进一步研究工作。