纳米硒合成细菌Lxz-41的鉴定、培养条件优化及其在富硒猕猴桃栽培中的应用

(陕西省微生物研究所,陕西西安 710043)

硒是生态系统中非常重要的营养元素,有着“生命元素”之称。1957年,Schwarz确定硒是人和动物必需的营养元素。1973年,硒被世界卫生组织认定是人体必需的微量元素,此后大量的研究表明,硒的营养和毒性剂量范围较窄,人体食物中硒含量少于0.05 mg/kg就会造成缺硒,大于5 mg/kg又会产生中毒[1]。硒在地球上分布不均匀,中国72%地区处于缺硒、低硒带,膳食中硒摄入量的不足严重影响着几亿人口的身体健康[2]。缺硒会引起人类的克山病、大骨节病、癌症、糖尿病、心脑血管病、不育症等疾病,而适当地补硒可以防癌、抗肿瘤和抗衰老[3-5]。近年来,随着人们越来越注重保健和养生,各种富硒产品应运而生,种植户为提高卖点,在种植过程中都喷洒无机硒(硒酸钠、亚硒酸钠)来提高产品中硒的含量。但是无机硒(硒酸钠、亚硒酸钠)毒性大,被常用危险化学品的分类及标志GB13690-2009列为第六类剧毒物质,无机硒的使用严重危害了环境和人类健康。

生物纳米硒是由微生物产生的,尺寸在纳米级别的单质硒形态[6],具有更宽的安全剂量范围,有望成为无机硒的替代品。根据急性毒性(LD50)数据显示[7],无机硒LD50=15 mg/kg,有机硒LD50=30～40 mg/kg,纳米硒LD50=113 mg/kg。迄今,纳米硒是已发现毒性最低的硒形态[8]。纳米硒的产生与细菌的氧化还原反应密切相关[9],随着研究的不断深入,能够合成纳米硒的微生物涵盖的种属极其丰富,超过30个属,包括大肠杆菌(Escherichiacoli)[10]、库德毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)[11]、乳酸杆菌(Lactobacillus)[12]等,但相关硒转化芽孢杆菌的研究相对较少。另外,芽孢杆菌在土壤中的抗逆性存活能力强,繁殖快,适合于后期制备纳米硒菌肥在土壤中施用。本实验以从陕西省紫阳县富硒土壤中筛选到的一株纳米硒转化芽孢杆菌为材料,对其进行了鉴定和纳米硒转化条件的优化,并初步应用在富硒猕猴桃的栽培中,以期为后期微生物纳米硒肥的应用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株Lxz-41 2016年分离自陕西省安康市紫阳县富硒土,菌株已保存至中国典型培养物保藏中心(CCTCC),编号M2016578;酵母粉、酵母膏、蛋白胨 北京奥博星生物技术有限公司;尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、正辛醇、无水乙醇 天津市天力化学试剂有限公司;葡萄糖、蔗糖 天津市科密欧化学试剂有限公司;亚硒酸钠 国药集团;IF-A增菌液 美国Biolog公司;Ezup DNA提取试剂盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;其它试剂 均为国产分析纯;斜面活化培养基 LB培养基;硒固体平板培养基 葡萄糖2%,酵母粉0.5%,氯化钠0.5%,亚硒酸钠0.1%,琼脂粉1.5%,pH自然;液体种子培养基 葡萄糖2%,酵母粉0.5%,氯化钠0.5%,pH自然;液体基础培养基 葡萄糖2%,酵母粉0.5%,磷酸氢二钾0.3%,磷酸二氢钾0.1%,氯化钠0.5%,亚硒酸钠0.15%,pH自然。

DHZ-D恒温摇床 苏州培英实验设备有限公司;HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;96Ⅱ超声细胞破碎仪 西安比朗生物科技有限公司;722可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;6700F扫描电子显微镜 日本电子株式会社;2760 PCR仪 美国应用生物系统公司(ABI);XRS凝胶成像系统 美国伯乐公司(Bio-Rad);Biolog自动微生物鉴定仪 美国Biolog公司;MK3酶标仪 美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的活化与形态观察 将保藏的lxz-41菌株接入斜面,30 ℃静置活化24 h后,将活化好的斜面在硒固体平板培养基上进行划线,通过观察菌落是否变红来检验菌株lxz-41是否具有亚硒酸钠转化能力[13]。刮取斜面活化菌落,进行2.5%戊二醛固定4 h,磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次,乙醇梯度脱水(分别为30%、50%、70%、85%、90%乙醇各1次,100%乙醇2次,15 min/次),乙酸异戊酯置换乙醇2次(20 min/次),每一步完成后经8000 r/min离心5 min。将样品分别在-20、-40和-80 ℃冷冻12 h,并进行-70 ℃真空冷冻干燥24 h后,扫描电镜观察菌体形态[14]。

1.2.2 lxz-41菌株的鉴定 取斜面菌落稀释至Biolog增菌液IF-A中,控制浊度达到90%～98%之间,然后加入到GenIII96孔板中,30 ℃静置恒温培养24 h,进行Biolog生理生化的鉴定。同时,取斜面菌落,采用细菌DNA提取试剂盒进行lxz-41菌种总DNA的提取,利用通用引物进行16S rDNA的扩增,PCR程序为94 ℃预变性4 min,94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30个循环,72 ℃修复延伸10 min,4 ℃ 冷却。PCR产物在上海生工生物工程有限公司进行一代测序,然后将序列进行NCBI数据库的比对,利用MAGE 5.0软件构建进化树[15]。

1.2.3 lxz-41菌株对亚硒酸钠的耐受性实验

1.2.3.1 耐受性的考察 按照1.2.1方法将菌株活化后,接种于液体种子培养基中,30 ℃、180 r/min摇瓶培养12 h,待用。分别配制亚硒酸钠含量为0、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、5000 mg/L液体培养基,加入到96孔板中,每孔加150 μL,每个浓度三个平行,同时做三块96孔板作为重复,然后每孔接入5 μL lxz-41种子液,30 ℃静置培养18 h后,立即测定600 nm吸光值和亚硒酸钠的转化率,同时进行扫描电镜,考察菌种lxz-41对亚硒酸钠的耐受情况。

1.2.3.2 亚硒酸钠转化率的测定 将方法1.2.3.1中培养18 h后的96孔板的重复孔进行混合,6000 r/min离心10 min取沉淀,加入无菌水,进行超声破碎(150 W,超声10 s,间歇5 s,共20次),10000 r/min离心2 min,取沉淀进行60 ℃烘干4 h,按照GB 5009.93-2017中电感耦合等离子体质谱法进行硒含量的测定,并计算纳米硒的转化率。

转化率(%)=(沉淀中硒总量/初始培养基中硒总量)×100

1.2.4 菌株lxz-41对纳米硒的转化条件优化 将1.2.1中活化好的斜面菌种转接于液体种子培养基中,30 ℃、180 r/min摇瓶培养12 h,即为种子液,并以1%的接种量接入亚硒酸钠浓度为1500 mg/L待优化的液体基础培养基中,在一定的温度和摇床转速条件下,以纳米硒转化率为指标,采用单因素和响应面试验对培养基组分与培养条件进行优化。

1.2.4.1 单因素实验 碳源种类及浓度的筛选:固定液体基础培养基中除碳源以外的其它组分不变,调整初始pH为7.0,保持1%接种量,在30 ℃下,150 r/min培养18 h,考察不同碳源种类(蔗糖、葡萄糖、饴糖、可溶性淀粉)对纳米硒转化率的影响,而后在最佳碳源种类下,考察碳源浓度(2%、4%、6%、8%、10%)对纳米硒转化率的影响,从而获得最佳的碳源种类及浓度。

氮源种类及浓度的筛选:固定液体基础培养基中除氮源以外的其它组分不变,调整初始pH为7.0,保持1%接种量,在30 ℃下,150 r/min培养18 h,以纳米硒转化率为指标,考察无机氮和有机氮种类(尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、酵母粉、酵母膏、蛋白胨)对转化纳米硒转化率的影响,且在最佳氮源组合下,分别考察了有机氮浓度(0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%)和无机氮源浓度(0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)对纳米硒转化率的影响,从而获得最佳的氮源种类及浓度。

初始pH的筛选:固定液体基础培养基的组分不变,调整培养基的初始pH分别为5、6、7、8、9、10,在30 ℃下150 r/min摇床培养18 h,考察不同初始pH对纳米硒转化率的影响。

温度的筛选:固定液体基础培养基的组分不变,调整初始pH为7.0,保持1%接种量,在不同培养温度(20、25、30、35、40、45 ℃)下150 r/min摇床培养18 h,考察温度对纳米硒转化率的影响。

转速的筛选:固定液体基础培养基的组分不变,调整初始pH为7.0,保持1%接种量,在转速分别为100、120、140、160、180、200 r/min的摇床中 30 ℃培养18 h,考察不同摇床转速对纳米硒转化率的影响。

1.2.4.2 响应面试验 根据单因素实验的结果,固定最佳的单因子条件,选取对结果影响显著的因素进行进一步的Box-Behnken试验,以蔗糖浓度、尿素浓度和培养温度为变量,纳米硒转换率为响应值,通过响应面进行条件优化,因素水平表见表1。

表1 Box-Behnken设计试验因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 微生物纳米硒肥的应用 按照1.2.3制备lxz-41种子培养液,并按照5%的接种量接入最优培养基中,进行10 L发酵罐纳米硒的合成发酵,18 h后,6000 r/min离心10 min取沉淀,并加入少量无菌水悬浮,进行超声破碎(150 W,超声10 s,间歇5 s,共20次)[16]。为方便后期农户使用,超声后的悬液用水稀释至硒含量为250 mg/L,即为液体微生物纳米硒肥。将实验制备的微生物纳米硒肥在周至农家乐果蔬合作社猕猴桃基地进行猕猴桃富硒小区实验,将液体微生物纳米硒肥用水稀释25倍,分别在猕猴桃开花期(5月)和果实膨大期(7月)进行叶面喷洒,10月进行人工采摘。每次喷施量为1.5 kg/棵或120 kg/亩。小区划分见表2,每个小区都是5行3列。待果实成熟后取样。进行果肉、果皮、叶中硒含量的测定。硒含量测定方法同1.2.3.2进行。

表2 陕西周至猕猴桃微生物富硒实验分区Table 2 Microorganism selenium-enriched experimentarea of kiwi from Zhouzhi,Shaanxi province

注:3×5代表实验区每组地块所种的猕猴桃的排列为3行5列,共15棵;CK组为未喷洒纳米硒样品;T1组为喷洒与纳米硒相同硒含量的亚硒酸钠样品;T2组为喷洒纳米硒样品。

取样方法:对每个地块采用蛇形取样法,共取5个样,保证每一行取一次样。另外,为对比硒在果实与枝叶中的分布情况,取样时要保证每个猕猴桃的果实、枝叶来自同一样本。每个地块样品混合,进行测定。

1.3 数据处理

以上实验均设置三组重复,结果以平均值±标准偏差的形式表示。单因素实验采用GraphPad 8.0软件进行绘图,采用SAS 9.0软件进行单因素显著性分析(P<0.05)。响应面实验采用Design Expert 8.0进行设计和结果分析.

2 结果与分析

2.1 lxz-41菌株形态及鉴定

图1a为菌株lxz-41在硒平板上培养24 h后的形态,从图1a中可以看出,菌株lxz-41能够在硒平板上生长,并且能够将亚硒酸钠还原成红色的胞内纳米硒。图1b是lxz-41经过戊二醛固定冻干后的电镜照片,可以看出菌体形态短杆状,两端椭圆,并且在培养基上形成褶皱。所以,由此可初步判断lxz-41可能是能够合成纳米硒的芽孢杆菌。

图1 菌株lxz-41硒平板与SEM形态Fig.1 Selenium plate and SEM morphology of strain lxz-41注:a:菌株lxz-41在1000 mg/L亚硒酸钠平板上的形态;b:菌株lxz-41在SEM下的形态(×1000)。

以菌株lxz-41总DNA为模板,采用细菌16S rDNA通用引物5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′ 5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′进行lxz-41 16S rDNA扩增,扩增产物见图2,大小为1500 bp左右的产物,切割目的条带,并用SK8131纯化试剂盒纯化后,送样测序。产物测序后,获得1404个碱基,并通过NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对后发现,菌株lxz-41属于芽孢杆菌属,并与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、死谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)、中川芽孢杆菌(Bacillusnakamurai)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)等序列相似度达到99%,利用MEGA 5.0 中N-J法构建系统进化树,如图3a,lxz-41与解淀粉芽孢杆菌的进化关系最为相近。进一步用Biolog GenIII细菌鉴定平板进行lxz-41的生理生化鉴定,结果如图3b显示,在71种C源中,lxz-41能够明显利用葡萄糖、乳糖等32种碳源,对蜜二糖、D-半乳糖等24种碳源呈现半利用状态,对D-果糖、葡萄糖醛酸等15种碳源完全无法利用。在23种化学因子中,对pH、氯化钠浓度、盐酸胍等13种化学因子展现较强的敏感性,而对醋竹桃霉素、利福霉素SV、洁霉素等10种化学药物不敏感。通过以上生理生化指标与Biolog数据库比对,并结合系统进化树的结果,确定lxz-41为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

图2 lxz-41 16srDNA 扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of lxz-4116S rDNA amplification products

图3 lxz-41 系统进化树(a)及Biolog GenIII 平板(b)Fig.3 Phylogenetic tree(a)and biologGenIII result(b)of lxz-41注:图3b中GenIII 96孔板中碳源及化学因子种类的分布见Biolog说明书。

2.2 菌株lxz-41对亚硒酸钠的耐受性

图4显示lxz-41对亚硒酸钠的耐受情况,可以看出随着亚硒酸钠浓度的升高,生物量(以OD600 nm表示)总体呈降低趋势,说明亚硒酸钠的加入对菌体的生长造成了一定的影响,相应的转化率也逐渐降低。当亚硒酸钠添加浓度为4500 mg/L时,培养18 h后,lxz-41的OD值为0.175,说明菌株lxz-41在液体条件下,仍然能够在含高浓度的亚硒酸钠培养基中缓慢生长,高于已报道的酵母菌[17]、乳酸菌[18]对亚硒酸钠的耐受能力。在亚硒酸钠添加浓度为1500 mg/L以下时,对生物量积累的影响不大,转化率也维持在60%左右的水平,在亚硒酸钠1000 mg/L及以下时转化率虽然保持在较高水平,但合成的纳米硒的总量比较低,由此,结合纳米硒的合成总量,本实验选取1500 mg/L作为亚硒酸钠的添加量进行后续实验。图5为菌株lxz-41发酵合成的纳米硒的扫描电镜,从图中可以明显看出纳米硒的颗粒形态,粒径大约在300 nm左右。说明lxz-41能够通过发酵合成纳米形态的硒颗粒。

图4 lxz-41对亚硒酸的耐受浓度Fig.4 Tolerance concentration of lxz-41 to selenite

图5 lxz-41合成的纳米硒扫描电镜(×10000)Fig.5 Scanning electron microscope ofsynthesized nano-selenium(×10000)

2.3 单因素实验结果

2.3.1 碳源种类对纳米硒转化的影响 图6对比了四种不同常规碳源对菌株纳米硒转化率的影响。可以看出,蔗糖与葡萄糖为碳源比饴糖和可溶性淀粉为碳源的转化率更高,以蔗糖为碳源时,在1500 mg/L亚硒酸钠添加量下,纳米硒的转化率为74.4%±5.1%,显示蔗糖相比于葡萄糖明显更有利于菌株lxz-41在硒环境中对硒的转化,所以选定蔗糖作为纳米硒转化的碳源。图7考察了不同蔗糖浓度对纳米硒转化率的影响。可以看出,随着蔗糖浓度的提高,纳米硒转化率呈现了先上升后下降的趋势,当蔗糖浓度为4%时,纳米硒转化率最高为76.1%±2.8%。所以选定4%的蔗糖浓度为后续响应面试验的考察浓度。

图6 碳源种类对纳米硒转化率的影响Fig.6 Effect of carbon source typeson conversion rate of nano-selenium

图7 蔗糖浓度对纳米硒转化率的影响Fig.7 Effect of sucrose concentrationon conversion rate of nano-selenium

2.3.2 氮源种类及浓度对纳米硒转化的影响 图8对比了有机氮、无机氮不同种类对菌株转化纳米硒的影响。结果显示,总体来看,有机氮的纳米硒转化率要优于无机氮源的纳米硒转化率。在有机氮种类中酵母粉是最适合的有机氮源,纳米硒转化率极显著高于其他有机氮源(P<0.01),无机氮源中尿素对菌体转化纳米硒具有极显著的促进作用(P<0.01)。所以选取酵母粉作为最佳的有机氮源,尿素作为最佳的无机氮源。

图8 氮源种类对纳米硒转化率的影响Fig.8 Effect of nitrogen source specieson conversion rate of nano-selenium

图9考察了酵母粉的不同浓度对纳米硒转化率的影响。从图9中可以看出,当酵母粉浓度在3%以下时,转化率维持在60%以上,且相差不明显。高于4%后,纳米硒的转化率降低,主要原因是因为过高的氮源浓度可能对菌株造成了渗透压力,调整期延长,在前18 h的生长率较低,所以造成了纳米硒的转化率随着氮源浓度的增大而降低。当酵母粉的浓度达到6%时,未见菌体生长,纳米硒转化率为0。图10为不同尿素浓度对纳米硒转化率的影响,从图10中可以看出,低浓度的尿素能够提升纳米硒的转化率,且当添加浓度为0.1%时,纳米硒转化率最高,而后随着尿素浓度的增大,纳米硒转化率逐渐降低,0.1%的尿素添加量效果最好。所以选定1%的酵母粉作为最佳的有机氮源及浓度,0.1%的尿素作为最佳的无机氮源及浓度。

图9 酵母粉浓度为纳米硒转化率的影响Fig.9 Effect of yeast concentrationon conversion rate of nano-selenium

图10 尿素浓度对纳米硒转化率的影响Fig.10 Effect of urea concentrationon the conversion rate of nano-selenium

2.3.3 不同初始pH对纳米硒转化的影响 图11显示了培养基不同初始pH下菌株对纳米硒转化率的影响。从图11中可以看出,在pH5～10范围内,随着pH的升高,转化率逐渐升高,当pH达到7.0时,最大转化率为62.9%±3.4%,但在pH为7、8、9时,菌株纳米硒的转化率变化并不明显。所以,选择初始pH=7.0作为最佳的培养基初始pH。

图11 初始pH对纳米硒转化率的影响Fig.11 Effect of initial pH on theconversion rate of nano-selenium

2.3.4 不同培养温度对纳米硒转化的影响 图12显示了不同培养温度对菌体转化纳米硒的影响.从图12中可以看出,随着培养温度的升高,纳米硒转化率呈现先上升后下降的趋势,原因可能是因为随着培养温度的升高,菌株的代谢活性增强,转化纳米硒的能力也增强,40 ℃时,转化率为74.1%±2.1%。但当培养温度达到45 ℃时,菌株生长受阻,纳米硒的转化率也降低。所以,选择培养温度为40 ℃作为下一步响应面试验考察的水平。

图12 培养温度对纳米硒转化率的影响Fig.12 Effect of culture temperatureon conversion rate of nano-selenium

2.3.5 不同摇床转速对纳米硒转化的影响 通常情况下,对好氧微生物来说,高的通氧量有利于好氧微生物的生长和代谢。图13显示了不同摇床培养转速条件对菌株转化纳米硒的影响。随着转速的提高,培养基中溶氧加大,纳米硒的转化率也有所提高,但当转速升高到160 r/min时,转化率达到64.3%±2.5%,而后随着转速的增大,纳米硒转化率变化不大。所以选定摇床转速为160 r/min作为纳米硒转化的最佳摇床转速。

图13 摇床转速对纳米硒转化率的影响Fig.13 Effect of shaking speed on conversionrate of nano-selenium

2.4 响应面试验结果

根据2.3单因素实验的分析结果,以纳米硒转化率为响应值,选取对菌株影响显著的因素(蔗糖浓度、尿素浓度、培养温度)进行响应面试验,应用Design Expert 8.0对实际结果与预测值进行分析对比,如表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiment

图14显示了变量A、B、C的交互作用响应面图,从图14中可以看出,响应面存在极大值,且靠近中心点附近。AB、AC交互作用的等高线呈椭圆形状,说明对响应值的影响显著,与方差分析结果一致。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance table

图14 各变量之间的交互作用对纳米硒转化率的影响Fig.14 The effect of interaction between variousvariables on the conversion rate of nano-selenium

注:**表示极显著(P<0.01),*表示显著(P<0.05)。对变量A、B、C分别求一阶偏导,得到编码数据A=0.32,B=0.08,C=0.17,对应实际变量参数A(蔗糖浓度)为4.32%,B(尿素浓度)为0.10%,C(培养温度)为40.51 ℃,在此条件下的理论Y值(纳米硒转化率)为83.6%。鉴于实验的可操作性,将响应面优化的因素最佳条件调整为蔗糖4.5%,尿素浓度0.1%,培养温度40.5 ℃,其它条件为酵母粉1%,磷酸氢二钾0.3%,磷酸二氢钾0.1%,氯化钠0.5%,亚硒酸钠0.15%,初始pH为7.0,培养温度40.5 ℃,转速160 r/min,培养18 h,纳米硒转化率为86.8%±4.7%,高于理论预测值,且相对误差为3.8%,说明此模型能够较好地反映实验的各因素与响应值的实际关系。

2.5 lxz-41在猕猴桃富硒种植中的应用

按照1.2.5制备微生物源纳米硒肥,并将其在陕西猕猴桃基地进行应用,应用品种为翠香和华优两个品种,经过生长期两次喷洒后,果皮、果肉、枝叶中硒的含量见表5。

表5 微生物纳米硒对猕猴桃的富硒效果Table 5 Selenium enrichment effect ofmicrobial nano-selenium on kiwifruit

注:“N”表示未检出硒。

从表4中可以看出,在猕猴桃栽培过程中,添加亚硒酸钠和纳米硒都能提高猕猴桃果实、枝叶中硒的含量,但微生物源纳米硒对猕猴桃的富硒能力要优于亚硒酸钠,且不会造成对土壤的污染。硒在猕猴桃各个部位的富集顺序都是枝叶>果皮>果肉,说明硒元素在枝叶中的富集能力要强于果实中的富集能力。通过对比文献发现,猕猴桃果实的富硒能力要低于稻米[19]、玉米[20]、高于晚秋黄梨[21],不同品种的猕猴桃富硒效果不同,在本次实验的猕猴桃品种中,翠香品种要稍优于华优。根据HB001/T-2013中国富硒食品含量分类标准规定水果及其制品中硒含量为0.01～0.050 mg/kg,本次实验的猕猴桃均符合标准要求。

3 结论

利用16S rDNA分子鉴定手段和Biolog GenIII平板对实验室保藏的一株纳米硒合成细菌lxz-41进行了鉴定,初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),并通过对亚硒酸钠的耐受性实验发现,该菌株具有较强的亚硒酸耐受能力,在18 h内能够耐受4500 mg/L的亚硒酸钠。以纳米硒转化率为指标通过单因素与响应面实验优化了菌株lxz-41转化合成纳米硒的培养基组分及培养条件,优化后的纳米硒转化条件为:蔗糖4.5%,尿素0.1%,酵母粉1%,磷酸氢二钾0.3%,磷酸二氢钾0.1%,氯化钠0.5%,初始pH为7.0,培养温度40.5 ℃,摇床转速160 r/min,在此条件下,纳米硒的最高转化率为86.8%±4.7%。将利用lxz-41菌株制备的微生物纳米硒用于富硒猕猴桃华优和翠香品种的栽培中,经检测猕猴桃果肉中硒含量分别达到了0.035、0.05 mg/kg,且展现了比无机硒(亚硒酸钠)更好的效果,为将来富硒猕猴桃的绿色栽培和其它作物的富硒种植提供参考。