颈静脉灌注精氨酸对奶牛血液生化指标及必需氨基酸含量的影响

周 刚，胡良宇，尹召华，丁洛阳，张 鑫，张 军*，王梦芝*

（1.淮安市农业科学研究院，江苏淮安 223001；2.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；3.扬大康源乳业有限公司，江苏扬州 225002）

精氨酸（Arginine，Arg）是目前发现的功能最多的一种氨基酸[1]，在动物体内具有重要的代谢调控和营养作用。Arg 不仅调控动物的生长发育、蛋白代谢及免疫功能，其对动物机体消化吸收脂溶性物质、降低机体血糖和抗应激反应等诸多重要的生理机能也具有调节作用[2]。刘庆等[3]利用高糖大鼠模型发现，Arg 可以改善血脂代谢紊乱以及胰岛素抵抗从而调节血糖，并防止大鼠血压升高。Fu 等[4]试验结果显示，饲粮中添加Arg显著降低了大鼠血清中葡萄糖（GLU）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平，其中TC 和LDL-C 的降低可能与Arg 提高脂肪组织中作用于葡萄糖氧化和游离脂肪酸关键基因的表达有关。另外，作为奶牛所需的必需氨基酸（Essential Amino Acid，EAA）之一，本课题组前期研究发现Arg 对奶牛乳腺酪蛋白合成的促进作用可能是通过改变血液各EAA 成分及总必需氨基酸（TEAA）含量以影响乳腺氨基酸吸收实现的[5]。以上研究均表明，Arg 在脂代谢、糖代谢和蛋白代谢过程中扮演重要的角色，但对于其如何具体影响泌乳奶牛代谢尚不得而知。为此，本研究在本课题组前期Arg 灌注对养分消化和氮利用[6]、酪蛋白合成[5]、免疫功能[7]等影响的研究基础上，通过向泌乳中期奶牛颈静脉中灌注Arg，研究其对奶牛血常规指标和血清生化指标以及血浆必需氨基酸浓度的影响，为进一步开展Arg 对奶牛营养代谢调节的研究提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计 在扬州大学实验农牧场选择6头体重相近、4 胎次、泌乳期（80±2）d、泌乳量（21.0±1.0）kg、体况3.0分的荷斯坦奶牛作为试验动物。

采用3×3 复拉丁方试验设计，将试验牛随机分为3 组，每组2 头，分别为对照组（酪蛋白模式组，1 倍Arg 灌注量）、Arg 灌注组（以体外细胞培养试验促进酪蛋白表达最优的2 倍Arg[8]，灌注量为37.66 g/d）、等氮丙氨酸组（与Arg 灌注组等氮，灌注量为77.24 g/d）。每期22 d，包括灌注期7 d，间隔期15 d。每天经由颈静脉滞留针匀速灌注8 h，灌注总量皆为4 L。灌注液由江苏省南京市剑桥生物科技有限公司配制。

试验期持续饲喂参照 NRC（2001）奶牛营养需要配制试验用基础饲粮（表1）。试验牛每日早晚2 次等量饲喂（先饲羊草、后饲混合料），挤奶3 次，自由饮水，饲养管理均保持一致。在试验牛左侧颈部静脉安装滞留针，安装后每天用无菌肝素钠生理盐水（750 IU/mL）疏通2 次。

1.2 血常规检测 每个试验灌注期结束时，对试验牛颈静脉采血，加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）抗凝管中，交由扬州市疾病控制中心，使用全自动血细胞分析仪对白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）、红细胞压积（Hct）、红细胞平均体积（MCV）、平均血红蛋白含量（MCH）、平均血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布变异系数（RDW-CV）和红细胞分布标准差（RDW-SD）等血常规指标进行测定。

1.3 血清生化指标测定 每个试验期结束时，对试验牛颈静脉采血，加入促凝管中，447.2 ×g 离心20 min 并取血清，4℃保存，送至扬州市疾病控制中心测定碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）、GLU、TC、LDL-C 和高密度脂蛋白（HDL-C）等血清生化指标。

表1 日粮组成和营养成分（干物质基础）

1.4 血浆EAA 浓度的测定 每个试验灌注期结束时，对试验牛颈静脉采血，加入EDTA-Na2抗凝管中，得到血浆脱蛋白后用L-8900 氨基酸分析仪（Hitachi High-Technologies，Dallas，TX，USA）分析氨基酸（AA）浓度。AA 标准混合溶液购自日本和光纯药工业株式会社（Amino Acids Mixture Type H，Osaka，Japan）。

1.5 统计分析 用SAS 9.0 软件中单因子方差分析（ANOVA）进行显著性检验和多重比较。结果表示为平均值± 标准差。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 颈静脉灌注Arg 对泌乳奶牛血常规指标的影响 由表2 可知，与对照组和等氮丙氨酸组相比，泌乳奶牛颈静脉灌注2 倍Arg 后，WBC、RBC、HGB、PLT、Hct、MCV、MCHC 等指标均有所下降，其中WBC 的下降达到极显著水平；而MCH、RDW-CV、RDW-SD等指标则表现相反趋势（P>0.05），以Arg 灌注组为高水平。

表2 颈静脉灌注Arg 对泌乳奶牛血常规指标的影响

2.2 颈静脉灌注Arg 对泌乳奶牛血清生化指标的影响 由表3 可见，等氮丙氨酸组HDL-C 高于对照组（P＜0.05），与Arg 灌注组差异不显著；TC 表现出相同的趋势，以等氮丙氨酸组最高（P>0.05）；而LDL-C 以Arg 灌注组最高，等氮丙氨酸高于对照组，但3 组无显著性差异。Arg 灌注组的ALP、LDH 相对其他2 组有所提高，而GLU 则表现为下降，但均未表现显著差异。

表3 颈静脉灌注Arg 对泌乳奶牛血清生化指标的影响

2.3 颈静脉灌注Arg 对EAA 的影响 如图1 所示，与对照组（P=0.03）和等氮丙氨酸组相比，灌注Arg 提高了血浆中Arg 浓度（P＜0.05）。其他8 种游离氨基酸和TEAA 浓度在3 组间没有显著差异。

3 讨 论

图1 颈静脉灌注Arg 对泌乳奶牛血浆EAA 的影响

3.1 Arg 灌注对泌乳中期奶牛血常规指标的影响 WBC是血常规检测中一项重要指标。当病菌侵入动物体内时，白细胞能通过变形而穿过毛细血管壁，集中到病菌入侵部位，将病菌包围、吞噬，是动物机体非特异性免疫的重要部分，并可以参与机体的特异性免疫[9]。奶牛正常的WBC 范围在8×109～9×109/L，如果体内WBC高于正常值，表示机体很可能存在炎症；WBC 减少则表明机体免疫能力下降，容易患感染性疾病。徐成[10]研究表明，向烧伤患者补充Arg 能够降低患者血清中WBC、RBC 和HGB 等指标，说明添加Arg 未能消除烧伤患者强烈的免疫应激状态，但一定程度上缓解了其炎症水平。本试验中各项血常规指标都维持在正常范围内，这说明Arg 在代谢过程中并没有显著危害到泌乳奶牛血细胞的正常数量，WBC 降低可能是由于颈静脉灌注滞留针引起的轻微炎症反应。

3.2 Arg 灌注对泌乳中期奶牛血脂代谢的影响 有研究发现，Arg 通过AMPK 通路增强了脂肪降解，从而减少了脂类物质的合成，降低了细胞质中瘦素、甘油三酯的浓度[11]。其中TC 占质膜脂类的20% 以上，是合成胆汁、维生素和激素的原料，因此血清TC 浓度可在一定程度上反映体内脂类代谢状况[12]。邹飞雁等[13]研究表明，补充Arg 后鹌鹑血清TC 水平下降33%；而麻名文等[12]报道添加Arg 能显著提高3 月龄断奶肉兔血清TC 含量，添加过量会出现相反的结果。本试验中添加2 倍Arg 与另外2 组的TC 水平无显著差异，说明添加此浓度的Arg 对奶牛血液TC 代谢未能产生显著影响，添加Arg 的不同结果可能与添加剂量和试验动物有关。另外，内源性胆固醇酯的主要运载体为LDL-C 和HDL-C，其中LDL-C 将脂类由肝脏向外周转运，LDL增高会引起血浆TC 和甘油三酯增高，而HDL-C 则分解代谢脂肪，减少脂肪沉积作用[14]。因此，维持一定浓度的HDL-C 有利于体内血脂代谢和转运。孙丰[14]研究发现，提高饲粮Arg 水平显著降低了肉仔鸡血清中LDL-C 含量，说明Arg 有助于减少脂肪沉积；而孙玲伟等[15]指出50%营养限饲的妊娠母羊每日饲喂20 g过瘤胃保护Arg 未显著影响血清HDL-L 和LDL-L 含量，推测Arg 对妊娠母体的营养代谢影响与胎儿生长发育受限程度有关。本试验中Arg 灌注组的HDL-C 水平与对照组和等氮丙氨酸组没有显著差异，而等氮丙氨酸组与对照组相比则表现出HDL-C 显著提高，这可能与丙氨酸促进脂肪代谢的能力有关。

ALP 是一组特异的磷酸酯酶，其活性的高低可反映动物的生长速度和生产性能。ALP 活性提高表明机体对蛋白和脂肪代谢效率提高[16-17]。正常情况下，细胞内ALP 由于细胞膜的屏障作用，不易逸出；当机体受到各种应激时，细胞膜的通透性升高使ALP 活性显著升高。因此，血清ALP 活性升高通常是应激反应的一个标志[18]。杨慧等[19]研究发现，添加1%Arg 显著提高断奶仔猪血清中ALP 活性；而刘玉兰[20]在基础饲粮中添加0.5% 和1.0% Arg 后，发现断奶仔猪血清中ALP 活性与对照组相比差异不显著，与潘杰等[21]报道结果相似。本试验中虽然ALP 在组间没有表现显著性差异，但上升趋势可一定程度上反映泌乳奶牛生产性能的提高，也可能是由于颈静脉灌注滞留针给泌乳奶牛造成轻微应激反应。

3.3 Arg 灌注对泌乳中期奶牛血糖代谢的影响 体内各组织细胞活动所需的能量大部分来自GLU，所以保持一定水平GLU 能维持体内各器官和组织的需要。反刍动物90%以上的GLU 是靠糖异生作用在体内合成，其余约10%来源于消化道吸收[22]。LDH 是参与糖无氧酵解和糖异生的重要酶，存在于组织细胞的胞质内，是肝功能检查中的重要项目。GLU 含量和LDH 活性能够共同反映机体受到应激的程度。

姜丽丽[2]研究表明，添加Arg 可显著降低28 日龄蛋雏鸭GLU 含量，具体表现为血清中的GLU 与饲粮Arg 添加水平呈显著的二次曲线相关，反映出Arg 调节血糖的能力，且这一调控作用具有浓度依赖性；而吕伟明等[23]试验表明，患有糖尿病的大鼠经过Arg 治疗以后其血清GLU 含量没有明显变化，推测Arg 对于存在糖代谢障碍大鼠的治疗缓解能力有限。而本试验中2 倍酪蛋白模式的Arg 添加量也没能改变GLU 水平，可能由于奶牛机体自身对于额外剂量的Arg 添加存在一定缓冲作用。另外，本试验颈静脉Arg 灌注组的LDH 较对照组有提高趋势，与吴信等[24]的试验结果一致；在特种动物水貂的研究中发现，在饲粮中添加适宜的Arg能显著提高育成期水貂血清中LDH 活性，说明适宜的Arg 能提高肝脏功能[25]。

3.4 Arg 灌注对泌乳中期奶牛血浆必需氨基酸含量的影响 奶牛所需的EAA 包括Arg、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸[26]。通过提供与乳合成需要模式相似的EAA，增加可吸收蛋白转化为代谢蛋白的效率，进而提高蛋白质利用率和转化效率[27]。先前研究表明EAA 灌注能影响乳蛋白合成[28-29]，泌乳奶牛乳腺摄取的EAA转化为酪蛋白的效率可高达81%[30]。Volden[31]指出，奶牛十二指肠消化物中总游离AA 增加8%会导致牛奶蛋白质含量增加5%。Wang 等[32]和Appuhamy 等[33]研究发现，改变EAA 的供应提高了乳腺总游离氨基酸，对乳蛋白产量也有一定影响。

尽管乳蛋白中Arg 含量相对较低（粗蛋白质的3.4%），但乳腺对Arg 的吸收效率较高，且对Arg 的摄取随着灌注Arg 的增加而增加，并随Arg 的缺失而下降[29]。Zhao 等[34]研究发现，LPS 处理显著降低血浆游离AA 和总游离AA 浓度，而添加Arg 减弱了这种趋势，恢复了血浆氨基酸浓度。本试验中，灌注Arg 可提高直接进入血液的Arg，进而提高了血浆中Arg 浓度。Dopel 等[29]同时发现动脉EAA 浓度随Arg 的添加有所增加；而Vicini 等[35]研究发现灌注Arg 并没有改变EAA 浓度。本试验灌注Arg 后血浆总EAA 浓度也未表现显著变化，这可能由于机体通过控制局部血流量调节氨基酸吸收，与其血浆浓度无关[36]。如Madsen 等[37]研究发现，对奶山羊补充过瘤胃保护的赖氨酸和蛋氨酸会增加动脉血赖氨酸和蛋氨酸的浓度，但乳腺对两者的吸收未改变。

4 结 论

在本试验条件下，颈静脉灌注Arg 显著提高了血浆Arg 浓度，但赖氨酸、蛋氨酸等其他游离氨基酸及TEAA 浓度没有显著差异；白细胞指数表现为显著降低，而其他血常规指标没有显著改变，表明添加Arg 不会影响奶牛正常的血液细胞组成。另外，Arg 灌注组HDL-C、ALP 等血脂代谢相关的血清生化指标有所提高，血糖浓度无显著性差异，表明Arg 对泌乳中期奶牛的脂类代谢水平有所调节。