小鼠胚胎母源基因转向合子基因组的转换起始点

肖红卫，华文君，华再东，任红艳，张立苹，郑新民，朱 喆，毕延震

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，湖北省动物胚胎工程与分子育种重点实验室，湖北武汉 430064）

随着动物发育到性成熟，生殖细胞中的亲本基因组需要通过包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、组蛋白替换等在内的一系列表观遗传修饰，变成高度特化的精子和卵母细胞[1]。受精后胚胎在早期发育阶段经历了全基因组重编程，擦除表观修饰，形成全能性的合子，从而启动胚胎发育[2-3]。前人通过一系列的研究发现，小鼠受精后胚胎基因组激活发生在2-细胞（2-cell）胚胎阶段[4-7]，在胚胎基因组激活前，合子发育由卵子发生过程中储存在成熟卵母细胞质中的母源因子（包括mRNA 和蛋白质）所调控。母体基因表达是卵母细胞成熟和早期卵裂的重要生物学过程。Cui 等[8]研究发现，随着卵母细胞的发育，大量基因在GV 期卵母细胞中的表达量与在MII 期卵母细胞中的表达量发生变化。在GV 卵母细胞中上调的基因更可能参与蛋白质代谢和修饰、有丝分裂细胞周期、电子传递或受精或属于微管/细胞骨架蛋白家族。在MII 卵母细胞中特异性上调的基因更可能参与DNA复制、氨基酸代谢或G 蛋白偶联受体和信号分子的表达。在卵子受精或核移植的胚胎激活后，这些母源因子启动早期胚胎发育，随后基因组开始转录，表达新的基因和合成新的因子，并发生级联反应，合成更多的细胞因子，保持早期胚胎继续发育[8]。上述科学家通过大量的先进研究方法，验证出小鼠胚胎发育过程中母源基因向合子基因转换的时机在胚胎发育的2-cell 期，但是这些胚胎活检方法复杂，容易受到分子检测的假阳性的影响，需要能够可以实时、直观观察小鼠胚胎发育过程中母源基因向合子基因转换的时机方法。

EGFP基因来源于水母（Aequorea victoria）[9-13]，于荧光显微镜下观察转EGFP基因的胚胎，可以发现转基因胚胎有绿光[13]。本研究利用EGFP基因作为报告基因，通过转增强型荧光蛋白（EGFP）基因小鼠（♀/♂）分别与野生型小鼠进行交配所得到的胚胎，研究小鼠胚胎发育过程中母源基因向合子基因组转换的时间节点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及胚胎来源 选择6～8 周龄（20 g 左右）EGFP转基因的公、母昆明小鼠，转基因小鼠由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物生物技术研究室提供[13]。6～8 周龄（20 g 左右）普通昆明小鼠包括5～6 周龄的健康母鼠和7～8 周龄的健康公鼠，由湖北省医学科学院实验动物中心提供。自由采食，自由饮水，每笼饲养小鼠5 只，垫料为锯木屑。环境温度与湿度不限制；照度为每天13 h 光照:11 h 黑暗；噪音无；环境清洁度属SPF动物房。动物饲养环境的级别属SPF 级[13]。

1.1.2 主要试剂与仪器 孕马血清促性腺激素（PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）均购自宁波三生药业有限公司；Olympus IX70 倒置荧光显微镜（Olympus 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1EGFP转基因小鼠与普通昆明小鼠交配EGFP转基因母鼠与普通昆明小鼠交配，以及EGFP转基因公鼠与普通昆明小鼠交配。

1.2.2 胚胎采集 合笼第2 天检查阴栓，见栓后4 h 内以及见栓后4～28 h，颈椎脱臼法处死母鼠，75% 酒精消毒后切开腹腔，剪下输卵管及连接的一小段子宫，置于有PBS 的平皿中，显微镜下用注射器从输卵管壶腹部、子宫角收集胚胎，并在镜下清洗后置于有M16 液滴的培养皿中，置37℃、5% CO2、100%湿度培养箱培养。

1.2.3 荧光显微镜下观察 把冲出的受精胚置于荧光显微镜下，用波长490 nm 的紫外光观察，滤光片为ND25 和WIB。

1.3 实验设计 本研究利用小鼠配子发育中的减数分裂以及受精的原理，在转增强型荧光蛋白（EGFP）基因小鼠（♀）与野生型小鼠进行交配的实验中，EGFP基因只能来自母鼠，所以用EGFP基因模拟母源基因；在转增强型荧光蛋白（EGFP）基因小鼠（♂）与野生型小鼠进行交配的实验中，EGFP基因只能来自公鼠，所以用EGFP基因模拟合子基因/父源基因。荧光显微镜下观察到绿色荧光的时期就是母源基因向合子基因组转换的时间节点。

2 结果与分析

2.1 转EGFP基因母鼠与普通昆明小鼠交配 收集转EGFP基因母鼠与普通昆明小鼠交配所得的胚胎，在荧光显微镜下观察所收集到的胚胎，可以观察到荧光，荧光主要分布在受精胚以及周围的颗粒细胞中（图1）。说明作为转入的外源基因在卵母细胞发育以及受精之前就已经表达。

图1 EGFP 转基因小鼠（母鼠）以及所取的胚胎

2.2 转EGFP基因公鼠与普通昆明小鼠交配 收集转EGFP基因公鼠与普通昆明小鼠交配所得的胚胎，在荧光显微镜下观察收集所得的胚胎，直到2-cell 期的胚胎时才可以见到有荧光（图2），荧光主要分布在受精胚中（图2 中的绿色荧光部分）。说明作为转入的外源基因在卵母细胞受精之后才开始表达。

图2 EGFP 转基因小鼠（公鼠）以及所获得的胚胎

2.3EGFP转基因小鼠的后代 收集EGFP转基因小鼠的胎儿，在紫外灯下观察发现，转基因后代小鼠胎儿中的荧光分布与胚胎发育初期中的分布特征并不一致，有全身呈现荧光的，也有在身体末端呈现荧光（图3-A），或者只有很浅的荧光（图3-B）。

图3 EGFP 转基因小鼠的后代

3 讨 论

母体-合子转变（Maternal-To-Zygotic Transition，MZT）过程是一个保守的过程，在此过程中母体环境通过显着的重编程转变为胚胎驱动发育的环境，这是继续发育所必需的[1]。在卵子发生过程中，哺乳动物卵子会积累早期胚胎发生所需的蛋白质。数据表明母源因子在染色质重编程和胚胎基因组激活中起着至关重要的作用。Yang 等[14]通过斑马鱼早期胚胎中RNA5-甲基胞嘧啶（m5C）修饰的全基因组分析发现，m5C mRNA修饰在MZT 期间动态调节母源基因转录物的分子机理。Zheng 等[15]研究发现，母源因子在早期切割小鼠胚胎发生中维持染色体稳定性和整倍性的作用。Filia 在生长的卵母细胞中表达，编码一种与MATER 结合的蛋白质，并参与卵裂期胚胎发育所必需的皮质下母体复合物。Filia 母体贮存的消耗削弱了胚胎植入前胚胎发育的非整倍性，这是由于异常的纺锤体组装，染色体错位和纺锤体组装检查点（SAC）失活引起的。为了确保正常的纺锤体形态发生，Filia 通过RhoA 信号传导途径调节关键纺锤体组装调节剂（即AURKA，PLK1 和微管蛋白）在微管组织中心的正确分配。同时，Filia 蛋白需要将MAD2（SAC 的一个重要组成部分）放置到动粒上，以实现SAC 功能[15]。Tsunemoto 等[16]研究发现，在卵母细胞和植入前胚胎中3 种小鼠母体基因（H1oo，Npm2和Zar1）的启动子区域在卵母细胞中显示出转录活性，但在受精胚胎中没有。Cui 等[8]、Sekita 等[17]证明，反转录转座子衍生的Rtl1（反转录转座子样1），也称为Peg11（父本表达11），对于维持胎儿毛细血管必不可少，并且其损失和其过量产生导致晚胎和/或新生儿老鼠的致死率。然而，卵受精后到胚胎基因组转录激活存在着一定的过渡期，小鼠胚胎发育时基因组的激活时间确定是研究的难点。本研究以EGFP转基因鼠为研究对象，以EGFP蛋白为基因组激活的标志物，在荧光显微镜下观察，小鼠胚胎在2-cell 期出现荧光，因此判断2-细胞胚胎期为基因组激活的时间点，这一结果与前人[6-7]的结果一致。

Zhou 等[18]研究发现，DNA 甲基化在着床后早期的时间窗口内可能参与特异性调控关键基因的转录，与基因转录共同协调决定了不同细胞谱系的发育潜能特化过程。本实验中收集到EGFP转基因小鼠胎儿体内的荧光分布与胚胎发育初期中的分布特征并不一致，可能是因为多细胞生物体由具有相同基因组的不同细胞类型组成，在器官组织发育过程中，无论在发育过程还是疾病状态下，表观遗传因素（不改变DNA 序列的情况下）在细胞命运决定中起着指导性作用，细胞类型和功能异质性往往通过调控基因表达来实现[19]。