黄淮杜泊羊繁殖性能和FecB 基因多态性研究

李 君，刘永斌，马驰骋，张子军，李甲申，董鹏飞，张道江，权 凯*

（1.河南牧业经济学院动物科技学院，河南郑州 450046；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010000；3.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036；4.河南省舞阳县畜牧局，河南舞阳 462400；5.浚县鑫林牧业有限公司，河南浚县 456282）

黄淮地区地处平原，灌溉条件便利，一直以来都是国家的重要产粮大区，属于温带季风气候，气候湿润，阳光充足，非常适宜农牧业发展。黄淮平原地区秸秆资源丰富，玉米秸秆、花生秸、豆秸年产量合计超过5 000 万t，但有效利用率不到57%[1]。为调整国家农业产业结构，加速农区草牧业发展，农业部（现为农业农村部）相继出台了《全国肉羊遗传改良计划（2015-2025）》和《全国草食畜牧业发展规划（2016-2020）》，计划培育10 个以上繁殖性能高、生长发育快的专门化（满足区域市场需求）肉羊新品种[2]，加快推进联合育种，支持和鼓励企业、高校和科研机构等成立联合育种组织[3]。因此，发展黄淮地区肉羊产业符合国家政策和市场发展的需要，但黄淮平原地区目前还没有相应的地方专门化肉羊品种，因此，加速黄淮地区肉羊新品种培育迫在眉睫。

黄淮杜泊羊是由河南牧业经济学院牵头，采用传统育种与基因育种相结合的方法，以小尾寒羊为母本，利用杜泊羊、特克赛尔羊和萨福克羊为父本，经过杂交创新、横交固定和群体扩繁3 个阶段培育出的适应黄淮地区的专门化肉用高繁绵羊品种。黄淮杜泊羊肉用体型外貌特征明显，早期生长发育快，饲料转化率高，遗传稳定，在黄淮地区适合作为专门化肉羊品种进行产业化推广。目前，黄淮杜泊羊扩繁群数量6 万余只，经济杂交群超过10 万只。绵羊骨形态发生蛋白受体-IB（Bone Morphogenetic Protein Receptor-IB,BMPR-IB）基因编码区发生突变（A746G），导致第249 位谷氨酰胺突变为精氨酸，造成绵羊排卵数增加，经证明249R 就是FecB的等位基因[4-5]。目前研究最多的FecB基因，即是BMPR-IB 突变引起的。FecB基因突变通过增加排卵数来增加产羔数，在湖羊和小尾寒羊，FecB是遗传方式已知的多胎主效基因[6-7]。本实验通过对黄淮杜泊羊繁殖性能指标进行统计分析，并采集血样、提取DNA，对FecB基因进行多态性分析，为黄淮杜泊羊新品种进一步选育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验时间和地点 本实验于2017 年10 月—2018 年10 月在黄淮杜泊羊核心育种场（河南绿源肉羊发展有限公司，河南省鹤壁市浚县鑫林牧业有限公司）进行繁殖性能测定。黄淮杜泊羊FecB基因多态性由河南牧业经济学院动物科技学院分子实验室分析。

1.2 实验动物与试剂

1.2.1 实验动物 实验动物为符合黄淮杜泊羊品种标准的育种核心群羊只，其中包括642 只初产母羊和1 684 只经产母羊，其繁殖性能评价指标和测定参照权凯[8]《羊繁殖管理指标的测定》执行；所有母羊发情鉴定、人工授精和妊娠诊断参照权凯[9]《羊人工授精操作流程》执行。整理收集1 年内642 只初产母羊和1 684 只经产母羊的发情、发情周期、发情持续期、人工授精、产羔等记录。

1.2.2 主要试剂 血液基因组DNA 提取试剂盒、DNA聚合酶、DNA Marker、琼脂糖等均购自北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶AvaⅡ购自NEB 公司。

1.3FecB基因多态性分析

1.3.1 血液采集和DNA 提取 黄淮杜泊羊核心群血样145份，其中初产母羊30 只，经产母羊115 只，颈静脉采血，肝素钠抗凝，采血后，颠倒混匀防止血液凝固，-20℃保存。按照全血DNA 提取试剂盒操作说明提取血液基因组DNA，经NANDROP 2000 检测OD260/280，检测合格的DNA 进行后续实验。

1.3.2 引物设计与PCR 扩增FecB基因（GenBank 登录号：NM_001009431.1）检测方法参照储明星等[10]制定的绵羊多胎主效基因FecB 分子检测方法，利用Primer 5.0 设计引物，其预期扩增产物大小为140 bp，上游引物序列为：5’-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3’；下游引物序列为：5’-CAAGATGTTTTCATGCCTCAT CAACACGGTC-3’，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR 扩增体 系（20 μL）：2×Taq PCR mix 10 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，模板DNA（20～30 ng/μL）1 μL，ddH2O 补 足20 μL 体 系。PCR 扩 增 条 件：94 ℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，33 个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。

1.3.3 RFLP 分析 用AvaⅡ限制性内切酶对扩增PCR 产物进行酶切，酶切反应体系为15 μL：PCR 产物5 μL，10×Buffer 1.5 μL，AvaⅡ限制性内切酶1 μL，去离子水7.5 μL。酶切反应条件为37℃水浴4 h。酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果并拍照。

1.4 统计分析 使用 Excel 2010 统计黄淮杜泊羊FecB的基因型频率、等位基因频率、多态信息含量（PIC）、杂合度和有效等位基因数，并进行 Hardy-Weinberg 平衡检测。数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 22.0统计软件单因素方差分析（ANOVA）中的LSD 法对黄淮杜泊羊基因型与产羔数进行关联分析，以P＜0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 发情特征 经观察，黄淮杜泊羊发情周期平均为（19.3±2.8）d，发情持续期平均为33～46 h。黄淮杜泊母羊初次发情在150～170 日龄，即5～6 月龄；第二次发情达性成熟，在6～7 月龄。

2.2 发情季节 如表1 所示，黄淮杜泊羊全年均可发情配种，发情配种集中在秋季，其中10 月最多，占15.45%，发情季节从高到低依次是秋季（9—11 月）、春季（3—5 月）、冬季（12 月至次年2 月）、夏季（6—8 月），分别占41.85%、36.4%、34.15%、31.24%，黄淮杜泊羊季节性发情不明显。

表1 黄淮杜泊羊不同月份发情统计

2.3 母羊年提供断奶羔羊数

2.3.1 繁殖率 由表2 可知，初产羊产单羔数居多，占比63.77%，平均产羔数为1.38 只；经产母羊产双羔数最多，占比67.64%，平均产羔数为1.85 只；黄淮杜泊羊平均窝产羔数为1.76 只，年繁殖率为252.82%。

2.3.2 母羊年提供断奶羔羊数 对3 992 只初生羔羊进行统计，发现羔羊断奶成活率为95.79%（3 824/3 992），每只母羊年提供断奶羔羊数=断奶羔羊数/母羊=3 824/1 602.17=2.39 只。

表2 黄淮杜泊羊产羔数

2.4FecB基因的遗传多态性

2.4.1FecB基因的PCR-RFLP 分析 利用所设计的引物对FecB基因目的片段进行PCR 扩增，产物经2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。如图1 所示，扩增出1 条特异性片段，扩增区域与预期扩增片段大小一致。将扩增的PCR 产物进行RFLP 检测，采用AvaⅡ限制性核酸内切酶对扩增片段进行酶切电泳分型，酶切后的片段经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，分型结果见图2。黄淮杜泊羊FecB基因存在3 种基因型，140/140 bp 为野生型（++型），140/110 bp 为杂合型（B+型），110/110 bp 为纯合突变型（BB 型）。

图1 FecB 基因PCR 扩增结果

图2 FecB 基因扩增产物Ava Ⅱ酶切结果

2.4.2FecB基因的遗传多态性分析 对黄淮杜泊羊实验群体FecB基因多态位点遗传参数统计分析，结果发现（表3），黄淮杜泊羊存在3 种基因型：纯合突变型（BB型）、杂合型（B+型）和野生型（++）型，基因型频率分别为0.082 8、0.606 9、0.310 3，且杂合型B+是群体中的优势基因型，有效等位基因数为1.901 5，杂合度为0.474 1，PIC 为0.361 7，即0.25＜PIC＜0.5，说明FecB基因位点在该群体是中度多态。χ2检验显示该位点基因型不符合Hardy-Weinberg 平衡（P＜0.05）。

2.4.3 不同基因型与产羔数的关联性分析FecB不同基因型与黄淮杜泊羊产羔数关联分析结果（表4）表明，BB 基因型产羔数比B+基因型多0.26 只，但差异不显著，BB 基因型比++基因型多0.72 只，差异极显著；B+基因型比++基因型产羔数多0.46 只，差异极显著。

3 讨 论

3.1 黄淮杜泊羊发情特性 黄淮杜泊羊初次发情期是5～6 月龄，性成熟为6～7 月龄，发情周期为19.3 d，发情持续期为33～46 h，其发情特征与中国地方品种小尾寒羊和湖羊基本一致[11]。黄淮杜泊羊发情期早于国外引入肉羊品种和国内其他绵羊品种[12-13]，如目前引入品种杜泊羊、萨福克羊、特克赛尔羊、无角道赛特羊等初情期均为6 月龄以上、性成熟8 月龄以上，且萨福克羊和特克赛尔羊呈现季节性发情[13]；国内无论巴美肉羊等培育品种，还是蒙古羊、阿勒泰羊等地方品种，发情配种均在8 月龄以上，每年一胎且以单羔为主[14]。从发情季节来看，黄淮杜泊羊季节性发情不明显，呈全年性发情特征，年发情配种率143.65%，说明其可以实现2 年3 胎。

3.2 黄淮杜泊羊产羔性能 黄淮杜泊羊平均窝产羔数为1.76 只，年繁殖率为252.82%，其繁殖率与小尾寒羊、湖羊等中国地方高繁绵羊品种接近[15]，且远高于杜泊羊、特克赛尔羊、萨福克羊、无角道赛特羊和夏洛莱羊等国外引入肉羊品种[16]。黄淮杜泊羊羔羊断奶成活率为95.79%，每只母羊年提供断奶羔羊数2.39 个，高于小尾寒羊、湖羊和巴美肉羊等中国地方品种和培育品种[17-18]。

表3 FecB 基因型频率、等位基因频率及群体遗传特性

表4 黄淮杜泊羊基因型与产羔数分析

母羊年提供断奶羔羊数不仅反映了品种的繁殖率，也反映了品种的环境适应性、母性及羔羊的饲养管理水平，因此，结果充分验证了黄淮杜泊羊的高繁殖性能，也体现了其对黄淮平原环境的适应性，说明黄淮杜泊羊在繁殖性能方面符合黄淮平原地区产业化发展所需的专门化肉羊品种标准。

3.3FecB基因的遗传多态性FecB基因是影响绵羊产羔数的主效基因，可作为分子标记进行辅助选育。郭慧慧等[19]对杜寒F1代进行了多胎候选基因检测，发现杜寒绵羊FecB基因存在3 种基因型，杂合型B+为优势基因型，且BB 和B+基因型个体的产羔数极显著高于++型个体。Mishra 等[20]发现在卡罗尔羊与马尔普拉羊杂交F1代中有78.4% 的个体中存在基因型为B+的FecB基因，并且其中55%可以繁殖出具有多胎性状的羔羊。本实验结果显示，黄淮杜泊羊FecB基因存在3种基因型，BB 型、B+型和++型，基因型频率分别为0.082 8、0.606 9、0.310 3，杂合型B+是群体中的优势基因型，且BB 基因型产羔数比B+基因型多0.26 只，BB 基因型比++基因型多0.72 只，B+基因型比++基因型产羔数多0.46 只，该结果从基因层面验证了黄淮杜泊羊多胎性，为下一步品种繁殖率的提升提供理论支撑，也为品种的选育和改良提供了科学依据。

4 结 论

黄淮杜泊羊具有性成熟早、多胎高繁的特性，其初情期为5～6 月龄、年繁殖率为252.82%、每只母羊年提供断奶羔羊数2.39 只。黄淮杜泊羊FecB 杂合型B+是群体中的优势基因型，基因型频率为0.606 9，B+型窝产羔数比++基因型高0.46 只。