CircHIPK3通过调控p53-Akt-Mdm2通路影响食管鳞癌的恶性表型

苟云久，马继龙，韩松辰，金大成，陈猛，王兵，柏启州

0 引言

食管癌是一种高发病率和高死亡率的疾病[1-2]，主要由食管黏膜上皮细胞异型增生而来，分为食管鳞癌和食管腺癌两种。发展中国家和亚洲地区食管癌病理类型主要是食管鳞癌，我国约86%以上的患者都属此列[3]。临床上晚期食管鳞癌5年总体生存率低于15%，早期食管鳞癌患者存活率则可以超过80%[4-6]。手术对早期食管鳞癌疗效确切，术后放化疗疗效仍有争议，靶向治疗已被证实对多种恶性肿瘤效果良好，但目前食管鳞癌的靶向治疗仍缺乏更加有效的治疗靶点。

环状RNA是一种非编码RNA，HIPK3可以产生22种环状RNA，其中3种存在于动物体内，其余19种存在于人体细胞。有研究发现CircHIPK3在多个恶性肿瘤内存在表达异常[7-9]。本文研究了食管鳞癌组织中CircHIPK3表达异常对食管鳞癌的影响，以期为食管鳞癌的诊断和靶向治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究人群及组织样本 本研究纳入11例临床患者病理资料，其中男8例、女3例；患者平均年龄（58.82±9.67）岁；1例患者家族中曾患类似疾病，余10例无遗传病史；5例有吸烟史；7例有饮酒史；中段食管鳞癌患者8例，上段和下段食管鳞癌患者分别为1例和2例，排除肿瘤位置位于贲门者（胃食管结合部肿瘤病理及治疗目前暂无确切研究结果，加入可能会影响研究结果）；肿瘤组织分型中，高分化2例、中分化6例、低分化3例；所有患者肿瘤分期均为可手术的Ⅰ期或Ⅱ期，其中Ⅰ期患者8例、Ⅱ期患者3例。术前对患者肿瘤大小、分期、肺功能、心功能进行评估，本研究中患者临床及病理分期标准为2013年AJCC分期。

根据术前病理活检进行筛选，对入选患者严格追踪观察，术后病理活检结果确定最终是否纳入研究。癌组织取自患者肿瘤部位，且显微镜下复查可见明显异形细胞；癌旁组织取自远离瘤体≥5 cm的位置，且在显微镜下复查时未观察到肿瘤细胞。

1.1.2 细胞EC9706细胞系购于中南大学湘雅医学院细胞库，选取传代少于6月的细胞，培养使用RPMI1640培养基；10%北美胎牛血清；1%双抗，5%CO2、37℃恒温培养。

1.1.3 主要试剂及仪器 CCK-8（Sigma,USA）、血清（Boehringer-Ingelheim company）、胎牛血清（Biological Industries,Israel）、Transwell 小室（Costar,USA）、Matrigel（Gibco,USA）、TRIzol（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）、ant-P53、ant-Akt和ant-Mdm2抗体购自美国Santa Cruz公司，β-actin鼠抗购自北京中杉金桥公司。过表达病毒及低表达病毒均由美国赛业公司合成构建。

1.2 方法

1.2.1 HIPK3表达量与食管鳞癌发生关系预测 通过GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）下载食管鳞癌患者相关数据，其中食管鳞癌患者共182例，非癌患者286例。对食管鳞癌患者HIPK3的表达量行数据分析，同时对不同分期的食管鳞癌患者的HIPK3的表达量进行数据分析。

1.2.2 过表达及低表达CircHIPK3食管鳞癌细胞株的构建及检测 将食管鳞癌EC9706细胞以5×105个/毫升的密度接种于6孔板中，每组设2个平行孔。对照组加入等体积PBS，12 h后分别更换新鲜培养液，于37°C,5%CO2,95%湿度环境中继续孵育。两天后收集细胞，用嘌呤霉素筛选。试验共分四组，高表达组、高表达对照组、低表达组和低表达对照组，见表1。

表1 试验分组Table1 Test grouping

1.2.3 细胞增殖实验 取对数生长期的转染细胞，0.25%的胰酶进行消化制成单细胞悬液，CCK-8法进行细胞计数。以每孔1×104个细胞的密度接种于96孔板中并继续孵育，第2、3、4天分别于每孔加入10 μl CCK-8，37℃孵育2 h后用酶标仪测450 nm波长处吸光度值。

1.2.4 细胞迁移实验 在24孔板中每孔接种1×105个细胞，加入0.1%BSA-RPMI1640，将Transwell小室置于24孔板中，加入细胞悬液100 μl。36 h后取出小室，甲醛固定，结晶紫染色，擦去滤膜内表面细胞。计数穿过滤膜的细胞数，每膜计数5个随机不同视野，每组设3次重复。

1.2.5 细胞侵袭实验 在滤膜内表面涂基质胶形成人工重组基底膜，其余步骤同迁移实验。

1.2.6 细胞凋亡实验 取对数生长期的细胞制成单细胞悬液，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.7 qRT-PCR 检测CircHIPK3 的表达情况 TRIzol提取细胞总RNA，依据反转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA，反应条件为37℃，15 min；85℃，5 s。GAPDH作为内参，反转录得到的cDNA作为模板按照qRT-PCR试剂盒说明书配制10 μl的PCR反应体系，见表2，反应条件为：95℃ 30 s，1个循环；95℃ 5s，60℃ 30 s，40个循环。测Ct值，基因的相对表达量采用2-ΔΔCt表示。

表2 PCR反应体系及计量表格Table2 PCR reaction system and metrological table

1.2.8 预测下游调控miRNA种类 通过生物信息学分析的方式，对CircHIPK3基因的下游miRNA和调控通路进行分析，然后再分别通过TargetScan 7（http://www.targetscan.org/mamm_31）、miRBASE（http://www.mirbase.org/）、miRDB（http://mirdb.org/）和DIANA（https://academic.oup.com）四种软件，使用Venn图法，取四种软件预测miRNA的交集进行验证，再通过单一数据库对下游miRNA进行评价预测。

1.2.9 Western blot检测CircHIPK3细胞相关蛋白的表达 RIPA提取蛋白，蛋白浓度与5×SDS蛋白上样缓冲液以1:4比例混合，煮沸变性后，10%的SDS-PAGE分离样品，将蛋白转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，将膜与一抗室温孵育2 h，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，暗室中加入ECL试剂，X线片曝光，显影和定影。在ImageQuant 350电泳凝胶成像分体系统中曝光拍照，并借助Image J软件对吸光度值进行分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白吸光度值/GAPDH蛋白吸光度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS24.0对实验数据进行分析，并用GraphPad Prism 6.0作图。运用t检验对两组数据进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIPK3与食管鳞癌的关系

通过对生物信息数据的分析，发现HIPK3高表达的食管鳞癌患者，生存率显著低于HIPK3低表达患者。对不同分期食管鳞癌患者的HIPK3表达进行分析，发现早期食管鳞癌患者的HIPK3表达较低，而晚期食管鳞癌患者的HIPK3表达较高，见图1。

2.2 CircHIPK3的表达在癌组织和癌旁组织中的差异

CircHIPK3在18例样本中明显高表达，其中高表达的癌组织（n=11）占所有高表达组织的61%，表达量明显高于癌旁组织（P＜0.005）。

2.3 CircHIPK3的异常表达对EC9706细胞增殖的影响

CCK-8结果发现：在CircHIPK3高表达时，肿瘤细胞的增殖速度明显加快，低表达的CircHIPK3肿瘤细胞增殖明显被抑制。即pcDNA3.1bcirc＞pcDNA3.1b＞NC＞shRNA，见图2。

2.4 CircHIPK3对EC9706细胞迁移能力的影响

研究结果发现CircHIPK3高表达的EC9706细胞迁移能力高于高表达对照组（P＜0.001）；CircHIPK3低表达EC9706细胞的迁移速度明显减慢（P＜0.001），见图3。

2.5 CircHIPK3对EC9706细胞侵袭能力的影响

研究结果发现CircHIPK3高表达的EC9706细胞侵袭能力高于高表达对照组（P＜0.001）；而CircHIPK3低表达的EC9706细胞侵袭能力明显低于低表达对照组（P＜0.001），见图4。

2.6 CircHIPK3的表达和EC9706细胞凋亡的相关性

CircHIPK3高表达的EC9706细胞的凋亡速度小于高表达对照组（P＜0.001）；而CircHIPK3低表达的EC9706细胞凋亡速度较低表达对照组增快（P＜0.001），见图5。

2.7 CircHIPK3和P53-Akt-Mdm2通路蛋白表达相关性

图1 HIPK3与食管鳞癌患者生存率和分期的关系Figure1 Relation between HIPK3 and survival rate(A),staging(B) of esophageal carcinoma patients

图2 CircHIPK3的异常表达对EC9706细胞增殖的影响Figure2 Effect of abnormal expression of CircHIPK3 on proliferation of EC9706 cells

图3 CircHIPK3对EC9706细胞迁移能力的影响Figure3 Effect of CircHIPK3 on migration ability of EC9706 cells

图4 CircHIPK3对EC9706细胞侵袭能力的影响Figure4 Effect of CircHIPK3 on invasion ability of EC9706 cells

本研究使用Venn图法对四种数据库进行分析，发现CircHIPK3影响的下游miRNA主要包括hsa-miR-302e；hsa-miR-520a-3p；hsa-miR-520e；hsa-miR-520b；hsa-miR-520c-3p；hsa-miR-520d-3p；单一数据库对CircHIPK3和miRNA的通路进行分析（CircHIPK3和miRNA的相关关系评分见表3），发现其主要功能的实现与p53-Akt-Mdm2通路相关。对四种CircHIPK3不同表达的食管鳞癌细胞的p53-Akt-Mdm2通路相关蛋白进行测定，结果发现：高表达的CircHIPK3细胞内的抑癌基因p53被明显抑制，而细胞内的Akt-Mdm2信号通路则处于激活状态，癌细胞增殖相关蛋白的表达量随之增加，其对癌细胞的影响较大，最重要的是导致癌细胞的生理过程包括增殖、迁移和侵袭以及相关癌症蛋白的表达增加，癌细胞的相关功能增强；反之，低表达的CircHIPK3则对癌细胞的功能有抑制作用，见图6。

3 讨论

本研究发现CircHIPK3在11例食管鳞癌标本中和7例癌旁组织中呈上调趋势，4例食管鳞癌旁组织样本中表达下调。基于CircHIPK3表达存在显著差异，本研究在细胞层面对CircHIPK3在食管鳞癌中的表达情况进行了进一步试验，实验结果表明：CircHIPK3表达升高促进食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡，而下调CircHIPK3表达具有相反的作用。有研究表明以上miRNA多与CD44因子和p53-Akt-Mdm2通路的表达相关[10-13]。本研究通过生物信息学对CircHIPK3的下游调控基因及蛋白进行了进一步分析，并使用Western blot进行验证，结果发现，当CircHIPK3低表达时，抑癌基因p53被激活，Akt-Mdm2信号通路被抑制，其表达的相关p53-Akt-Mdm2通路蛋量减少，癌细胞的功能抑制。

图5 CircHIPK3的表达和EC9706细胞凋亡的相关性Figure5 Correlation between CircHIPK3 expression and apoptosis of EC9706 cells

表3 CircHIPK3和mirRNA的相关关系评分Table3 Correlation score between CircHIPK3 and mirRNA

研究者们通过对人体肿瘤组织的基因组测序发现，环状RNA在膀胱癌、肠癌、肝癌、肺癌等人体多种实体肿瘤中呈现特异性表达，且通过参与多种肿瘤相关蛋白如WNT和VEGF等的合成过程发挥作用[9,14-15]。Zheng等[8]研究发现circHIPK3在多种癌症的癌组织和癌旁组织中差异稳定。此后，较多研究[9,16-17]也得到类似的结果。

肿瘤蛋白p53是抑癌基因的一种。p53基因在各种内外因素的作用下（包括物理辐射、化学污染、生物及病毒因素等多种因素）发生突变后，其空间构象随着改变，此时，p53基因失去了对细胞的正常调控，使细胞和组织癌变。研究表明，在所有恶性肿瘤中，该基因的突变率约50%[18]。

丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）是一种原癌基因，在调控细胞功能方面发挥重要作用[18-20]，且其对于肿瘤细胞的调节途径与p53完全相异；Mdm2是一种人体的癌蛋白，是p53基因的主要调节蛋白，Mdm2突变与p53突变不共存，可通过特异性结合p53阻断其生物学活性，与肿瘤的增殖密切相关[21-22]。同时Akt可以稳定Mdm2蛋白的作用，协同Mdm2抑制p53活性[23-25]。因此，我们推测CircHIPK3可能通过该通路调节食管鳞癌细胞的生理活性。

本研究首先通过慢病毒构建具有不同CircHIPK3表达水平的食管鳞癌细胞系，观察到p53-Akt-Mdm2信号转导途径中相关mRNA和蛋白的水平随CircHIPK3的表达不同而改变。在稳定过表达CircHIPK3的细胞中，Akt-Mdm2通路的作用被促进，同时抑癌基因p53作用被抑制，癌细胞的功能增强。CircHIPK3低表达则结果相反。

图6 CircHIPK3和P53-Akt-Mdm2通路蛋白表达相关性Figure6 Correlation between CircHIPK3 and P53-Akt-Mdm2 pathway protein expression

综上所述，本研究结果发现CircHIPK3促进人食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制细胞凋亡，这可能通过调节p53-Akt-Mdm2信号通路来实现。因此，CircHIPK3存在作为食管鳞癌潜在靶点的可能性，但本研究对其具体作用通路和机制表述仍不明确，还需要更大样本和更深入的研究。