纳米细菌感染在女性膀胱过度活动症发生中的作用研究*

何 鹏,王永权,潘进洪,周占松,张 恒

(陆军军医大学西南医院全军泌尿中心,重庆 400038)

膀胱过度活动症(overactive bladder,OAB)是女性泌尿系统极其常见的一种疾病。根据最新的国内泌尿外科诊治指南，OAB的定义是一组以尿急症状为特征的症候群，常伴有明显尿频和夜尿增多表现，可伴有或不伴有急迫性的尿失禁症状，部分患者有下腹及会阴部不适症状，严重影响女性患者的生活质量。目前稳定膀胱的治疗方法因周期长会导致较高的医疗费用，其诊治和寻求有效的治疗方法已成为国际泌尿界的难题[1-2]。然而女性OAB的病因至今仍不清楚，有逼尿肌不稳定、膀胱黏膜感觉功能过敏及神经内分泌学说等。临床实践中发现女性OAB患者多有尿路感染病史，且检查尿中微生物高于正常对照，抗感染治疗常有效，表明膀胱黏膜有隐匿性感染，即病原微生物引起OAB的可能。目前为止，仍没有在女性OAB患者中明确检出相关的病原体，因此对未知的病原体进行探索有可能对该病的临床诊治产生较大的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2012年5月至2017年10月在本院泌尿外科门诊确诊为OAB的25例女性患者为研究对象，年龄21～55岁，中位年龄31岁，尿常规和培养结果均为阴性。

1.2方法

1.2.1NB培养 严格清洁患者尿道外口后，收集10 mL中段尿，孔径0.45 μm滤器过滤，4 ℃ 20 000 g离心，弃上清液后留取管底1 mL，再加入无菌生理盐水稀释5倍，充分混匀，0.22 μm滤器再次过滤，同样条件再次离心，留取管底沉淀1 mL。加入4 mL 10% γ-FBS的RPMI 1640培养基，在5%CO2、pH 7.4、37 ℃的条件下无菌培养。

1.2.216S rRNA鉴定 将1 mol/L HCl 0.5 mL加入菌液标本，充分混匀,水浴30 min，37 ℃；1 mol/L Tris碱0.5 mL加入中和，4 ℃ 20 000 g离心40 min。管底沉淀使用细菌基因组提取试剂盒提取后进行PCR扩增。NB 16S rRNA基因序列(GenBank登录号:X98419)上游引物5′-AAC GAA CGA CTG GGG CGG CAG GC-3′,下游引物5′-CAC CCC AGT CGC TGA CCC-3′。PCR反应体系： 模板DNA 3 μL，PCR 2×TaqPCR Master-Mix 12.5 μL，上游引物1.0 μL(10 μmol/L)，下游引物1.0 μL(10 μmol/L)，加DDH2O至25.0 μL。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环，72 ℃ 7 min。所有循环结束后，取5.0 μL反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测目标基因。

1.2.3NB对膀胱黏膜上皮细胞的影响 将培养的膀胱黏膜上皮细胞(上海然泰生物公司)分为空白对照组(胎牛血清、1640培养液+膀胱黏膜上皮细胞) 和NB组(光密度2.00的NB 菌液、胎牛血清、1640培养液+膀胱黏膜上皮细胞)，在12、24 h分别进行光镜和透射电镜的观察。细胞经胰酶消化、离心,标本再转移至EP管内，PBS清洗10 min,加入质量分数3%戊二醛，固定1～2 h,PBS清洗2次,加入质量分数1%的锇酸，固定1～2 h,再用PBS清洗2次,依次使用50%、70%和90%的乙醇梯度脱水，再无水乙醇脱水3次。环氧丙烷浸透，Epon812包埋和聚合，80 ℃过夜。超薄切片后铀、铅染色。4 000倍及20 000倍显微镜下观察制片的细胞形态与结构变化。

1.2.4细胞损伤的指标检测 通过测定培养12、24 h后乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)来评价细胞膜的损伤程度及是否有脂质过氧化参与损伤过程中。LDH和MDA测试盒比色法分别测定上清液LDH和MDA水平，所有操作按试剂盒(上海生工)说明书进行。

2 结 果

2.1PCR法扩增NB 16S rRNA 25例尿液标本培养4周后，可观察到17例(68%)管底出现絮状的乳白色沉淀物，将培养标本离心后通过16S rRNA进行扩增鉴定，发现15例(60%)在1 406 bp处可见NB的特异性条带，证明所收集标本培养的细菌为NB，见图1。

图1 16S rRNA基因片断扩增

2.2NB对膀胱黏膜上皮细胞的损伤作用 空白对照组膀胱黏膜上皮细胞规则,细胞核及细胞质形态致密,线粒体形态正常，核膜完整，无明显异常。NB组细胞12 h细胞质内可见较大空泡样变，线粒体肿胀，24 h后部分细胞可见核膜溶解,核仁消失，见图2。

A:正常对照，细胞形态规则；B:细胞皱缩，脱落；C:细胞质内可见散在的空泡样变；D:核膜溶解，核仁消失

图2细胞形态与结构变化

2.3MDA和LDH水平变化 NB组MDA和LDH水平在12、24 h均高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同时间点两组LDH和MDA水平变化

3 讨 论

NB的发现及其致病特点为阐明女性OAB的病因提供了一条崭新的思路。NB是一种非常特殊的细菌，1992年芬兰科学家KAJANDER等在哺乳动物细胞培养时偶然发现，该细菌革兰氏染色呈阴性，大小为50～200 nm，外观多呈球状或有一端突起，不像普通细菌一样有荚膜与鞭毛，该细菌对四环素有特殊的敏感性，并在特殊的RPMI 1640或DMEM等哺乳类细胞培养基中才能生长。由于具有很多特性，且体积微小，KAJANDER等将之命名为Nanobacteria，进一步的研究发现NB确实存在，而不是体积上的纳米颗粒，并且和很多病因不明的感染性疾病有关[3]。

目前的研究证实，NB在人群中的感染率较高，可能会导致多种感染性疾病，其潜在的致病作用引起了临床上的广泛关注[4]。NB感染虽然与多种人类疾病的发生有关,但普通临床的检测方法不能确诊，NB具有特异的16S rRNA序列，因此，可以通过16S rRNA基因片段扩增来鉴定NB[5-6]。NB致病机制主要包括两个方面：(1)NB生长过程中可以形成坚硬的生物外壳，成分主要是羟磷灰石碳酸盐矿物结晶，导致被感染细胞发生类似骨骼样的病理性钙化，从而使组织器官硬化，这种病理改变在人类多种系统中均可发现，但病因一直不明。(2)NB通过分泌一些生物毒素及细胞炎性因子(如白细胞介素-1、白细胞介素-6和内毒素等)，引起了感染组织的炎症和慢性疾病。

泌尿系统是体内感染的NB主要的排出通道，因此可能与男性泌尿生殖系的感染性疾病有关，现在明确在泌尿系结石、前列腺和睾丸钙化患者的标本中相继培养出NB。目前众多研究证实NB感染和肾结石形成有关，通过单克隆抗体免疫荧光染色对70余例肾结石标本培养的NB进行鉴定，发现感染率高达97.2%，发病机制可能与NB导致的细胞脂质过氧化等反应有关[7-9]。笔者所在部门的前期研究证实NB感染和慢性前列腺炎有关，并可能是导致前列腺结石形成的致病因素，通过从临床确诊的Ⅲ型前列腺炎患者分离培养出的NB，再灌注入实验大鼠前列腺，可以有效地导致前列腺的炎症，通过四环素治疗可明显的缓解[10-11]。

女性OAB的病因仍不清楚，但有研究表明，许多OAB患者曾有尿路感染，抗感染治疗也常有效，膀胱黏膜有可能存在非常规的隐匿性感染，即特殊病原微生物引起OAB的可能。NB的生物矿化能力可能导致软组织感染、损伤和钙化，进而可能导致其他疾病，NB可能是钙化相关疾病和感染病因不明确的疾病的一个因素,其与因为钙化形成的屏障导致临床治疗的困难[12]。NB可能参与了OAB致病的主要依据有：NB可感染人体多种细胞，体内感染的NB主要经泌尿系统排出，因而其在泌尿系统中的潜在感染不容忽视。NB在普通的微生物培养条件下不能生长繁殖，可能与临床上很多OAB患者尿液标本采用常规微生物培养法检测不出病原，但膀胱黏膜却有慢性炎症存在有关。本研究发现，在女性OAB患者尿液中可以分离培养出NB，并且导致培养的膀胱黏膜上皮细胞损伤，因此，可以推测NB的感染可能参与了OAB患者膀胱黏膜上皮细胞损伤，导致膀胱黏膜的慢性炎症。但目前还有待进一步的研究，主要是因为纳米颗粒也有可能致细胞的损伤，即有生命的NB和纳米颗粒的鉴别还需要更多的实验来证实。但从目前的研究结果来看，深入探讨NB在OAB中的病因作用，有望为该病的临床治疗提供新的病原学依据。